β防御素2真核表达载体的构建及其在肝癌细胞Hepa16中的稳定表达

　　　　　　 作者：梅寒芳 金小宝 朱家勇

【摘要】 　　目的 克隆抗菌肽β防御素2（mBD2）基因，构建真核分泌性表达载体，使其在Hepa16细胞中稳定表达。方法 Trizol试剂提取C57BL/6鼠肾总RNA，RTPCR扩增mBD2成熟肽基因，OverlapPCR在成熟肽基因上游加上鼠IgК信号肽基因，克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)，PCR、酶切和测序鉴定正确后，脂质体法转染Hepa16细胞，G418筛选，RTPCR和Western印迹法从mRNA和蛋白角度鉴定mBD2分子的表达。结果 成功克隆含有信号肽的IgКmBD2序列，并且构建pcDNA3.1(+)/IgКmBD2真核分泌性表达载体，实现了mBD2分子在Hepa16细胞中稳定表达，RTPCR从细胞总RNA中扩增得到202 bp的IgКmBD2基因，Western印迹法鉴定细胞培养上清中有mBD2蛋白分子表达。结论 成功构建了pcDNA3.1(+)/IgКmBD2真核分泌性表达载体，转染得到稳定表达mBD2的Hepa16细胞株，为进一步研究mBD2的生物学特性及抗肝癌机制奠定细胞学基础。

【关键词】 防御素；天然免疫；肝癌；OverlapPCR

　　【Abstract】 Objective To clone beta defensin 2 (mBD2) gene from total RNA of mouse kidney， and to construct mBD2 secretary eukaryotic expression vector， then realize its expression in Hepa16 cells. Methods Total RNA was isolated from kidney of C57BL/6 mice by Trizol reagent. DNA sequence coding for mature mBD2 was amplified by RTPCR. To add a murine Igκ signal peptide sequence by overlapPCR. After successfully TA clone， IgκmBD2 was subcloned into the plasmid pcDNA3.1 (+).The pcDNA3.1 (+) / IgκmBD2 was identified by PCR， endonuclease digestion， and sequencing. The Hepa 16 cells were transfected with pcDNA3.1(+)/IgκmBD2 by Liposome2000 and selected with 400 mg /L G418 for 8 w. Identification of steady expression of mBD2 was confirmed by RTPCR and Western blot. Results The eukaryotic expression vectorpcDNA3.1 (+)/IgκmBD2 was successfully constructed. Stable expressional cell line of Hepa 16 was obtained by transfecting pcDNA3.1 (+)/IgκmBD2 into Hepa 16 by Liposome2000. The steady expression of mBD2 was confirmed by RTPCR and Western blot. Conclusions The eukaryotic vector of pcDNA3.1 (+) / IgκmBD2 is successfully constructed， and mBD2 stable expressional Hepa 16 cell line is identified， which is good foundation for further research on biological characteristic and antitumor mechanisms of mBD2.
　　
　　【Key words】 Defensin;Natural immunity;Liver cancer;OverlapPCR

　　肝癌的发病率和死亡率占肿瘤的第二位〔1〕，由于起病隐匿，多数患者在发现时已失去手术机会，姑息治疗复发率高，5年生存率仅7%〔2〕。因此，如何为肝癌患者创造二期手术机会，防止复发和转移是肝癌治疗的首要问题。β防御素2（mBD2）是抗菌肽的一种，是天然免疫的重要组成部分。Biragyn等〔3〕研究表明mBD2可趋化未成熟树突状细胞，还可作为TLR4的内源性配体促进树突状细胞成熟，产生一系列促炎症因子、趋化因子，上调共刺激分子表达，是一种天然的免疫佐剂。本研究将构建mBD2分泌性真核表达载体，并实现mBD2分子在肝癌细胞Hepa16中的分泌性、稳定性表达，为后续制备肝癌疫苗、探索新型抗肝癌的生物免疫治疗方法奠定细胞学基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　6～8周龄C57BL/6小鼠，由广东省医学实验动物中心提供。真核表达质粒pcDNA3.1(+)为本室保存，Hepa16细胞株由中山医科大学细胞中心提供，RPMI1640细胞培养基(Gibco公司产品)、Trizol由Invitroge公司提供，DL2000、MMLV、Taq enzyme、dNTP、T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamHⅠ、XbaⅠ等购自Takara公司，DL10000 DNA Marker为MBI公司产品。质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自北京天根公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成。羊抗鼠mBD2多克隆抗体购自Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG抗体购自北京博奥森生物技术公司，DAB显色试剂盒为中杉金桥公司产品，真核转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。凝胶成像仪购自BioRad公司(USA)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 C57BL/6小鼠肾组织总RNA的提取及cDNA合成

　　取6～8周龄C57BL/6鼠，颈脱臼处死，无菌条件下分离鼠肾组织，参照Invitrogen公司Trizol试剂说明书提取肾组织总RNA。取2.5 μg总RNA进行反转录，总体积为50 μl，反应条件为70℃ 10 min，42℃ 60 min，70℃ 15 min。采用oligo d(T)作为随机引物，获得cDNA，-20℃保存，PCR待用。

　　1.2.2 PCR扩增目的基因

　　根据GenBank中查得的mBD2基因序列设计扩增mBD2成熟肽基因序列的引物，上游引物为:5′ GAACTTGACCACTGCCACACC3′， 下游引物为(框内部分为XbaⅠ酶切位点)： 5′GCTCTAGATTATCATTTCATGTACTTGCAAC3′，扩增产物长度为131 bp。反应条件为：94℃ 2 min；94℃ 1 min，53℃ 1 min，72℃ 40 s，共30个循环；72℃ 10 min。成熟肽基因序列扩增成功后，再以稀释50倍的上述PCR产物为模板，采用OverlapPCR的方法，使用下述引物，分两步PCR，在mBD2成熟肽基因上游加入鼠IgΚ分泌性信号肽基因序列(5′ATGGAGTCAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTG
GGTTCCAGGTTCCACTGGTGAC3′)。上游引物1：5′CTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGAACTTGACCACTGCCACACC3′；上游引物2(框内部分为BamHⅠ酶切位点)：5′CGGGATCCATGGAGTCAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGC
TGCTCTGGGTTCCAGGTTCC3′；下游引物(框内部分为XbaⅠ酶切位点)：5′GCTCTAGATTATCATTTCATGTACTTGCAAC3′。两步PCR扩增片段长度分别为161 bp和202 bp，反应条件分别为：第一步PCR:94℃ 2 min；94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 40 s，共30个循环；72℃ 10 min。第二步PCR：94℃ 2 min；94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 40s，共30个循环；72℃ 10 min。同时设立小鼠βactin基因作为内参照，其引物序列为上游引物： 5′ATGGATGACGATATCGCTGCGCTGG3′，下游引物： 5′TCTTTGATGTCACGCACGATTTCCC3′。扩增片段 641 bp。

　　1.2.3 mBD2真核表达载体的构建与鉴定

　　对第三步202 bp的PCR产物TA克隆后，将含有IgКmBD2的pMD20T载体和pcDNA3.1 (+)载体分别采用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收IgΚmBD2目的片段和酶切后的pcDNA3.1 (+)载体，T4 DNA连接酶催化，16℃连接过夜，连接产物转化DH5α 感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选，挑取阳性克隆，采用菌液PCR鉴定，质粒提取后进行BamHⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定，将上述两种方法鉴定正确的质粒送深圳华大基因公司测序。采用无内毒素质粒抽提试剂盒提取鉴定正确的pcDNA3.1(+)/IgКmBD2质粒，脂质体法转染Hepa16细胞。

　　1.2.4 mBD2稳定表达株的筛选及RTPCR鉴定

　　Hepa16细胞采用含有100 ml/L胎牛血清、100 mg/L青霉素及1×105 U/L链霉素的RPMI 1640培养基，于37℃、50 ml/L CO2 条件培养。将对数生长期细胞用上述培养基调至浓度为2×108 ～5×108/L，2 ml/孔种至6孔板，细胞贴壁生长至大约80%融合时进行脂质体转染。以pcDNA3.1(+)/IgКmBD2质粒4 μg/孔、转染试剂10 μl/孔转染，同时设立空载体pcDNA3.1(+)转染组及不转染的对照组。5 h后换液，48 h后用含有400 mg/L G418的完全培养液进行筛选，G418筛选4 w后挑选单克隆进行扩增，8 w后提取细胞总RNA，RTPCR鉴定目的基因IgК mBD2 mRNA的表达。

　　1.2.5 稳定表达株培养上清mBD2蛋白的Western印迹法鉴定

　　各组细胞调整至浓度为109/L，培养3 d后，收集细胞培养上清，采用16.5% TrisTricine凝胶进行SDSPAGE分离，转膜，5%的脱脂奶粉室温封闭2 h，再与1∶500倍稀释的羊抗mBD2多克隆抗体4℃孵育过夜；TBS洗涤后，与1∶5 000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG抗体室温孵育2 h，洗涤后，DAB显色。

　　2 结 果

　　2.1 mBD2真核质粒的构建及鉴定

　　6～8周龄C57BL/6鼠处死后，分离肾组织，提取总RNA，反转录生成cDNA，经过三步PCR扩增，最终得到202 bp的基因片段(见图1)，βactin内参照为641 bp。PCR产物TA克隆后，将含有目的基因的pMD20T载体用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切，酶切后回收的目的片段与经同样双酶切后回收的pcDNA3.1 (+)载体经T4 DNA连接酶催化连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，用含有Amp的LB平板筛选阳性克隆，挑取单克隆震荡培养，菌液PCR鉴定。提取质粒，BamHⅠ及XbaⅠ双酶切鉴定，20 g/L琼脂糖凝胶电泳显示获得202 bp的插入片段(见图2)。测序证实构建的真核表达载体含有正确的IgКmBD2基因序列，无移码，无突变。

　　2.2 真核转染及稳定表达株的筛选

　　在6孔板中采用pcDNA3.1(+) /IgКmBD2和pcDNA3.1(+)质粒对Hepa16细胞进行转染，48 h后在培养基中加入G418进行稳定筛选，4 w后挑取单克隆进行克隆扩增培养，获得稳定表达株。

　　2.3 稳定表达株的RTPCR鉴定

　　单克隆扩大培养后，各细胞株进行总RNA提取，RTPCR扩增同样得到了202 bp的IgКmBD2目的片段，证实稳定筛选得到的Hepa16细胞株有mBD2基因mRNA表达，见图3。

　　2.4 稳定表达株的Western印迹法鉴定

　　单克隆扩大培养后，收集各细胞株培养上清，Western印迹证实稳定筛选得到的pcDNA3.1 (+) /IgКmBD2转染Hepa16细胞培养上清中有mBD2蛋白表达，而空载体pcDNA3.1(+) 转染组及未转染Hepa16细胞的培养上清中没有mBD2蛋白表达，见图4。

　　3 讨 论

　　抗菌肽是多数生物体在细菌感染后通过特殊的调节机制而释放的一种带正电荷的两亲性分子，其具有的免疫调节功能越来越引起人们的关注，甚至有人主张免疫调节功能才是抗菌肽的主要功能〔4〕。防御素是抗菌肽分子中最重要的组成部分，包括α防御素、β防御素、植物防御素和昆虫防御素。Biragyn研究小组用编码非免疫原性淋巴瘤抗原与mBD2融合蛋白的DNA质粒免疫小鼠，在小鼠体内诱发明显的抗肿瘤活性〔5〕；王国庆等〔6，7〕构建mBD2与血管内皮钙黏附素及mBD2与血管内皮生长因子2融合质粒免疫小鼠，通过抑制结肠腺癌和肺癌血管增生而发挥抗肿瘤作用。刘贵霞等〔8〕将带有信号肽的mBD2基因与科萨奇病毒B3VP1基因连接，构建成分泌型融合基因重组质粒免疫小鼠能获得较高水平的中和抗体和特异性CTL活性，使血清病毒滴度明显降低。可见，mBD2作为小鼠天然免疫反应的组成部分，可协助非免疫原性抗原在小鼠体内诱导出有效的特异性获得性免疫反应，是一种天然的免疫佐剂。

　　国内学者马小彤将mBD2真核表达质粒成功转染鼠淋巴细胞性白血病细胞L1210，实现其稳定性、分泌性表达，再对稳定表达mBD2的细胞株辐射制备瘤苗，此瘤苗能够诱导小鼠产生强烈的抗白血病免疫治疗和免疫预防效应，其免疫保护机制是mBD2促进NK细胞活性和IFNγ产生，并且诱发强烈的CTL活性〔9〕。本研究从小鼠肾组织提取RNA，反转录后从中扩增mBD2的成熟肽基因序列，并通过OverlapPCR技术克隆含有鼠Igκ信号肽序列的分泌性mBD2成熟肽基因，并将其亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中，脂质体法将pcDNA3.1(+)IgκmBD2 成功转染鼠肝癌细胞hepa16中，使mBD2蛋白分子在此细胞中稳定性、分泌性表达，为后续进一步制备肝癌疫苗、探讨mBD2抗肝癌作用机制奠定细胞学基础。

参考文献

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　　4 Bowdish DM，Davidson DJ，Hancock RE.Immunomodulatory properties of defensins and cathelicidins〔J〕. Curr Top Microbiol Immunol，2006；306:2766.

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　　9 Ma XT，Xu B，An LL，et al.Vaccine with βdefensin2 transduced leukemic cells activates innate and adaptive immunity to elicit potent antileukemine responses〔J〕.Cancer Res，2006；66 (2):116976.