MRL/lpr狼疮小鼠CD4+CD25+调节性T细胞和相关基因的研究

　　　　 作者：卢雪红 田庚 杨巍 李一 顾华

【摘要】 　　目的 通过研究MRL/lpr系统性红斑狼疮（SLE）小鼠（模型组）胸腺、脾脏中CD4+CD25+调节性T细胞（Tr）数量和相关基因的变化，探讨Tr在SLE发病中的作用。方法 采用间接免疫荧光法检测模型组和对照组血清中抗核抗体水平，流式细胞术检测胸腺、脾脏中Tr数量，RTPCR检测Tr功能基因表达水平。结果 抗核抗体模型组均为阳性，而对照组均为阴性；胸腺、脾脏中Tr数量模型组与对照组无明显差别；Foxp3的表达水平在模型组胸腺中与对照组无明显差别，而在模型组脾脏中却低于对照组；CTLA4的表达水平在模型组胸腺和脾脏均高于对照组。结论 Tr数量的变化在MRL/lpr小鼠的发病中不起关键作用，而Tr功能的变化，尤其在外周的功能缺陷可能是其发病的原因之一，至于Tr的抑制功能是否真正发生变化，还有待于进一步通过体外抑制功能的检测来确定。

【关键词】 MRL/lpr小鼠；系统性红斑狼疮；CD4+CD25+调节性T细胞；小鼠

　　【Abstract】Objective To investigate CD4+CD25+ regulatory T cells and target genes in thymus and spleen of MRL/lpr mice. Methods Serum antinuclear antibody was detected by indirect immunofluorescence. CD4+CD25+Tr was determined by flow cytometry and its target genes were detected by RTPCR. Results Antinuclear antibody was positive in model group but negative in control group. There were no significant differences of CD4+CD25+Tr in model and control groups. Foxp3 levels of model group was no significant difference in thymus but lower in spleen compared with that of control group. CTLA4 levels of model group had higher than those of control group both in thymus and in spleen. Conclusions MRL/lpr mice do not occur as a result of reduced level of CD4+CD25+Tr， but function defect of CD4+CD25+Tr may be responsible for its occurrence. But the suppressive effect of CD4+CD25+Tr is still need to be confirmed by vitro test.

　　【Key words】MRL/lpr; Systemic lupus erythematosus; CD4+CD25+ regulatory T cells; Mouse

　　CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell，Tr)是健康个体T细胞群的重要成员，通过与靶细胞的相互接触、下调靶细胞上白介素(IL)2Rα的表达，以及抑制抗原提呈细胞(APC) 提呈抗原而抑制免疫应答。除CD25外，这群细胞还表达多种分子，与其功能的发挥密切相关，如CTLA4，GITR，Foxp3等，尤其是Foxp3可特异性表达在Tr细胞上。很多研究发现，Tr数量减少可导致器官特异性自身免疫性疾病的发生〔1〕，但在器官非特异性自身免疫病〔如系统性红斑狼疮（SLE）〕中的作用报道不多，因此探讨Tr在SLE中数量和功能的变化将为这一类疾病的发病机制和寻找新的治疗靶点奠定基础。
　　
　　MRL/lpr小鼠是常用的SLE 动物模型之一，其症状与人类SLE相似，含有与细胞自发性程序性死亡有关的Fas 基因隐性突变〔2〕，出现淋巴细胞增生基因，导致T 细胞增生，全身淋巴结肿大，加速了自身免疫反应。Hori等〔3〕的研究表明Foxp3基因敲除的小鼠会出现明显的淋巴增生而导致自身免疫病的发生，那么Tr数量及其功能的变化是否参与MRL/lpr小鼠的发病呢？本文选用MRL/lpr小鼠，对照组选用BALB/C小鼠，检测了胸腺、脾脏中Tr的数量和功能基因表达水平，以了解Tr在SLE发病中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　7只MRL/lpr SLE小鼠购自北京斯莱克动物中心，7只BALB/C小鼠由吉林大学基础医学院动物中心提供，均为雌性，10周龄，模型组体重为30～37 g，对照组19～21 g。FITC标记山羊抗小鼠IgG为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。抗核抗体试剂盒为德国欧蒙公司产品。FITC标记的抗小鼠CD25单克隆抗体（mAb）（FITC抗CD25 mAb）及PE标记的抗小鼠CD4 mAb (PE抗CD4 mAb)为英国B.D.公司产品。尿蛋白试纸为广州市花都高尔宝生物技术有限公司产品。荧光显微镜为日本Olympas产品。流式细胞仪（FACSCalibur）为美国BECTON DICKINSON产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 检测尿蛋白

　　用尿蛋白试纸蘸取小鼠尿液，与标准尿液分析试纸条的颜色，并进行比较，结果以“-、+、、、”表示。

　　1.2.2 检测抗核抗体

　　采用间接免疫荧光法：按试剂盒说明操作，荧光二抗为FITC标记山羊抗小鼠IgG，于荧光显微镜下观察结果。

　　1.2.3 小鼠肾脏病理变化的观察

　　小鼠断颈处死，取其肾脏，用100 ml/L甲醛固定后，依次进行系列梯度脱水、浸蜡、包埋及切片（厚度2 μm）后，按常规进行HE、PAS、PAM、Masson染色，于光镜下观察结果。

　　1.2.4 小鼠胸腺、脾脏中Tr数量的检测

　　将小鼠以颈椎脱位处死，取其胸腺、脾脏组织并制备细胞悬液，TrisNH4Cl裂解红细胞。混匀后，取1×106个细胞再用200 μl的PBS混悬，加2 μl FITC抗CD25 mAb和5 μl PE抗CD4 mAb，置冰浴中30 min，以PBS洗1次。经500 μl 20 g/L多聚甲醛固定后，用流式细胞仪进行检测。

　　1.2.5 检测

　　Tr功能基因cDNA逆转录采用Takara的AMV RTase，按说明书进行操作。通过预实验确定PCR反应条件和最适循环数，以保证PCR产物量与起始cDNA量呈线性相关。

　　1.2.6 RTPCR产物的检测

　　取5 μl PCR产物，1.5%的琼脂糖凝胶（含0.5 μg/ml溴化乙锭）5 V/cm 进行电泳，凝胶扫描成像系统记录电泳结果。用Imagemaster VDS(Pharmacia Biotech)图像分析软件分析光密度值，以Foxp3、CTLA4/βactin光密度比值来表示其mRNA表达水平，琼脂糖电泳以DL2 000 bp DNA ladder V(Takara)相对分子质量为标准，实验各组RTPCR扩增的Foxp3、CTLA4及βactin条带与相对分子质量标准位置相同。

　　1.3 统计学处理

　　组间比较采用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 小鼠尿蛋白的检测

　　对照组均呈阴性“-”；模型组中3只为“+”，4只为“”。

　　2.2 小鼠肾脏病理变化的观察

　　模型组小鼠肾脏病理表现为系膜细胞增生，或出现细胞性新月体。见图1。

　　2.3 抗核抗体的检测

　　对照组抗核抗体均为阴性，模型组抗核抗体滴度为1∶320～1∶1 000，选择1只狼疮小鼠的检测结果见图2。表1 两组CD4+CD25+Tr/CD4+T细胞数量(略)

　　2.4 胸腺、脾脏中CD4+CD25+Tr/CD4+T细胞的比例

　　流式细胞术检测的结果显示：模型组和对照组CD4+CD25+Tr/CD4+T细胞比例无明显差别(P＞0.05)。见表1。
2.5 CD4+CD25+Tr功能基因检测结果 见图3，表2。表2 MRL/lpr SLE小鼠CD4+CD25+Tr功能基因水平(略)

　　3 讨 论

　　SLE是一种常见多因性自身免疫病，病因和发病机制尚未完全阐明。其中MRL/lpr小鼠〔2〕是常用的SLE动物模型之一，其症状与人类SLE相似，包括显著的血清自身抗体、免疫复合物肾小球肾炎，血管炎等。MRL/lpr含有与细胞自发性程序性死亡有关的Fas基因隐性突变，出现淋巴细胞增生，导致T细胞增生，全身淋巴器官肿大。本实验结果和文献报道一致，MRL/lpr小鼠出现蛋白捏，抗核抗体滴度达到1∶320～1∶1 000，肾脏出现明显的病理损伤，表明实验所用的MRL/lpr小鼠全部处于发病状态。

　　近年来发现的Tr具有免疫抑制作用，能抑制多种自身免疫病的发生，包括1型糖尿病〔4〕、实验性过敏性脑脊髓炎、炎性肠病等。但Tr在炎症性自身免疫病(包括SLE等）中的作用一直未得到肯定结论，原因之一是因为CD25是T细胞活化的标志，在炎症性自身免疫病外周淋巴器官及外周血中存在大量活化T细胞，通过流式细胞术测得的Tr混有部分活化T细胞。

　　本研究的结果显示MRL/lpr与BALB/c小鼠胸腺、脾脏中的Tr在数量上无明显差别，而MRL/lpr小鼠Foxp3的表达在胸腺无明显区别，而在外周淋巴器官脾脏却是模型组显著弱于对照组。其原因可能是，越来越多的证据表明胸腺不是Tr的唯一产生器官，Tr还可以在外周诱导产生，抗原的性质及剂量是诱导Tr生成的重要因素之一。有报道通过静脉注射及口服低剂量抗原肽可诱导外周Tr生成并表达活性，但其确切机制尚不清楚。诱导外周Tr产生的抗原不仅包括自身抗原，还涉及细菌、病毒、真菌、寄生虫甚至免疫抑制剂(如维生素D3、地塞米松等)等许多外源性抗原〔5〕。不同性质及剂量的抗原除在机体内诱导产生具有不同抗原特异性Tr外，在不同部位经由不同途径诱导产生的Tr种类及其所介导的免疫病理过程亦有所差别。在抗原持续刺激的情况下更易诱导外周Tr的产生，感染免疫是最典型的例证。尽管MRL/lpr小鼠存在多种自身抗原，但Tr的数量和功能在外周并未相应增强，并且MRL/lpr小鼠脾脏Foxp3的表达水平低于正常小鼠，提示该鼠外周诱导Tr存在缺陷可能参与MRL/lpr小鼠的发病。

　　Foxp3是CD4+CD25+Tr发育和行使功能的必需转录因子，除Foxp3外，Tr表面表达一种重要的膜分子：细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 (CTLA4，CD152)。CTLA4是淋巴细胞表面的一种与免疫信号传递有关的配体蛋白分子〔6〕，属于免疫球蛋白超家族成员，为Ⅰ型膜蛋白分子。CTLA4与B7结合后，负调节T细胞的活化，可减缓细胞周期的进程，降低IL2的产生，使T细胞活化增殖受到抑制，从而使免疫达到平衡状态，保持外周的免疫平衡。CTLA4表达于Tr是否对于其产生和发挥抑制功能起重要作用，目前尚无肯定结论。Hiroshi〔7〕等利用CTLA4转基因鼠与CTLA4-/鼠回交使其过表达，CTLA4在Tr的过表达并没有改变Foxp3mRNA的表达；即使过量表达CTLA4的CD4+CD25T细胞并未使其产生免疫抑制效应，而CTLA4-/的幼鼠CD4+CD25+脾细胞在体外却显示出抑制活性，这些结果均提示CTLA4对于CD4+CD25+Tr发挥抑制功能可能不是必需的。本实验结果显示MRL/lpr小鼠不论中枢还是外周CTLA4的mRNA表达水平均高于BALB/C小鼠，提示表达于CD4+CD25+Tr的CTLA4在MRL/lpr小鼠的发病过程中可能不起关键作用；另一可能性为CTLA4不仅表达于CD4+CD25+Tr，亦表达于活化T细胞，而MRL/lpr小鼠体内活化T细胞增多，这也是导致CTLA4的mRNA表达水平均高于BALB/C小鼠的原因。

　　总之，MRL/lpr狼疮小鼠的发病可能不是由于Tr数量减少所致，而其功能的变化，尤其在外周的功能缺陷可能参与其发病，这将为SLE寻找新的治疗靶点提供依据。

参考文献

　　1 Shohei H，Takashi N，Shimon S.Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3〔J〕.Science，2003；(299)：105761.

　　2 张飚，唐福林.系统性红斑狼疮模型鼠MRL/lpr研究进展〔J〕.中华风湿病学杂志，2006；2（10）：1103.

　　3 Asano M，Toda M，Sakaguchi N，et al.Autoimmune disease as a consequence of developmental abnormality of a T cell subpopulation〔J〕.J Exp Med，1996；184(2):38796.

　　4 Kukreja A，Cost G，Marker J，et al.Multiple immunoregulatory defects in type1 diabetes〔J〕.J Clin Invest，2002；109(1):13140.

　　5 Cristina CP，Joseph LA， Boesteanu ML，et al.Role of TCR specificity in CD4+CD25+ regulatoryTcell selection 〔J〕.J Clin Invest，2002；109(1):13140.

　　6 David MS，Lucy SK，Walke R.The role of Cd28 and cytotoxic Tlymphocyte antigen4 (CTLA4) in regulatory Tcell biology〔J〕.Immunol Rev，2006；21(2)：13148.

　　7 Hiroshi K，Shigekazu T，Kan T，et al.CD25+CD4+ regulatory T cells exert in vitro suppressive activity independence of CTLA4〔J〕.Int Immunol，2005；17（4）：4217.