神经甾体化合物对PC12细胞损伤的保护作用

【摘要】 　　目的 研究神经甾体化合物（CPU 0303）对h3O2和Aβ25～35所诱导的PC12细胞损伤的保护作用。方法 用h3O2和Aβ25～35造成PC12细胞损伤模型，采用MTT比色法检测细胞存活率，同时检测乳酸脱氢酶(LDH)活力和丙二醛(MDA)。结果 CPU 0303能显著减少细胞死亡，降低LDH漏出量及MDA生成。结论 CPU 0303对PC12细胞损伤具有保护作用。

【关键词】 β淀粉样蛋白；PC12细胞；神经甾体

　　阿尔茨海默病(AD)是一种可引起大脑智能进行性衰退的神经系统退行性疾病。其中，神经元外的β淀粉样蛋白(βAP)沉积，形成老年斑的中心，并造成神经元的受损，是AD重要的神经病理学特征，被公认为 AD 发病中的关键环节之一，因而探讨βAP的神经毒作用机制，成为AD研究中的热点〔1〕。而在神经退行性病变中，神经细胞损伤涉及多种因素，微循环障碍可导致细胞能量供应短缺，缺血后再灌注所致的一氧化氮和氧自由基损伤等，可加重细胞病变的进展。近年来研究发现神经甾体如孕烯醇酮、孕酮等，对衰老、记忆、行为等活动具有调节作用，目前在中枢神经调节中所起的作用越来越被人们所重视〔2〕。CPU 0303是一种新型的孕激素衍生物，本实验通过建立PC12细胞损伤模型，初步探讨其对神经细胞损伤的保护作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　神经甾体化合物 (CPU 0303) 为孕激素衍生物，由中国药科大学向华副教授提供，溶于DMSO 配制成0.1 mol/L的母液，用时加PBS稀释至所需浓度。PC12细胞株购自上海细胞所。小牛血清（杭州四季青工程材料研究所）；胰蛋白酶（华美生物工程公司）；DMEM培养基、Aβ25～35和MTT)购自Sigma 公司；乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品；其余试剂均为市售分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 PC12细胞培养及其损伤模型的建立
PC12 细胞复苏后接种于培养瓶中，加入含10％小牛血清的DMEM培养液，置于37℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养，2～3 d换液1 次。取对数生长期细胞用于实验。

　　1.2.2 实验分组

　　空白对照组，常规加入培养液；Aβ25～35损伤模型组，加入终浓度为20μmol/L 的Aβ25～35培养24 h；h3O2氧化应激损伤模型组，加入终浓度为100 μmol/L h3O2作用24 h；给药组，用终浓度为0.01，0.1，1 μmol/L的CPU 0303预处理30 min，然后加入各损伤剂共同作用24 h。每组6孔。

　　1.2.3 MTT法检测细胞存活率

　　细胞分组处理后，每孔加入0.5 mg/ml MTT 20 μl，置于培养箱中继续孵育4 h后，吸弃孔内上清液，加入DMSO，150 μl/孔，振摇10 min，使结晶充分溶解。用酶标仪在波长为570 nm处测定每孔的吸光值，按公式计算抑制率：抑制率%=〔（OD给药组-OD模型组）/（OD空白对照组-OD模型组）〕×100%。

　　1.2.4 LDH活力测定

　　PC12细胞损伤作用发生24 h后，收集培养液200 μl，按LDH试剂盒测定说明，用全自动生化分析仪测定上清中所含LDH 浓度。按公式计算抑制率：抑制率%=(LDH模型组-LDH给药组)/(LDH模型组-LDH对照组)×100%。

　　1.2.5 脂质过氧化物MDA测定

　　PC12细胞损伤后，去除原培养液，用PBS洗2次，加入0.1 mol/L PBS-0.05 mmol/L EDTA(pH8.0)及1% Triton X100溶解细胞，加入25% H3PO4沉淀蛋白，于4℃ 6 000 r/min 离心50 min，取上清液，按试剂盒说明，采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量。按公式计算抑制率：抑制率/%=(MDA模型组-MDA给药组)/(MDA模型组-MDA对照组)×100%。

　　1.3 统计学处理

　　两样本均数比较采用t检验，结果以x±s来表示。

　　2 结 果

　　2.1 CPU 0303对细胞存活率的影响

　　与空白对照组相比，模型损伤组的细胞存活率明显下降（P＜0.01）。CPU 0303能明显抑制损伤，提高细胞的存活率，呈剂量相关性（P＜0.05，P＜0.01）。见表1。表1 CPU0303对PC12损伤模型中细胞增殖的影响（略)

　　2.2 CPU 0303对LDH释放的影响

　　与空白对照组相比，模型损伤组LDH的释放明显增加（P<0.01)，CPU 0303能明显降低损伤细胞LDH的释放，并有剂量相关性。见表2。表2 CPU0303对PC12损伤模型中LDH含量的影响（略)

　　2.3 CPU 0303对MDA含量的影响

　　与空白对照组比较，模型损伤组MDA生成显著增多（P＜0.01），CPU 0303能减少细胞MDA的生成，并呈剂量相关性（P＜0.01，P＜0.05）。见表3。表3 CPU0303对PC12损伤模型中MDA含量的影响（略)

　　3 讨 论　

　　本研究分别采用可溶性Aβ25～35和h3O2用于PC12细胞，造成AD早期病理损害模型和氧化应激损伤模型。Aβ25～35是具有生物活性的片段，在凝聚形成Aβ纤维的过程中，对神经细胞显示毒性作用，对引起与AD病相关的神经元变性起关键作用〔3〕。其机制可能是在形成Aβ纤维的过程中诱发反应性氧自由基(ROS)在神经元中聚集，氧化应激和继发钙离子平衡的破坏〔4〕。同时在病理条件下，机体产生大量自由基，或机体抗氧化防御系统遭到破坏，造成细胞结构和功能的破坏，最终导致自由基从正常线粒体电子传递链中漏出。自由基所介导的脑损伤不仅发生在缺血期间，而且在随后的血液再灌注过程中仍是导致脑损伤的主要原因〔5〕。而且，在Fe3+和超氧阴离子自由基(O-2)的存在下，h3O2可以转化成毒性更强的羟自由基(·OH)。因此，降低神经细胞内活性氧的含量，是保护脑组织免受缺血/缺血再灌注损伤的有效方法。

　　本实验研究发现CPU0303对PC12细胞损伤有一定的保护作用。结果显示，CPU0303对Aβ2535和h3O2损伤模型均可提高存活细胞比率，抑制细胞LDH释放，减少MDA生成，并具有剂量相关性。Aβ25～35诱导细胞损伤时，细胞膜蛋白质糖基化、交联以及脂质过氧化，破坏细胞膜及线粒体膜的通透性，细胞大量损伤死亡。CPU0303具有抑制Aβ25～35诱导的细胞毒性作用，同时具有一定的自由基清除能力，对h3O2诱导的PC12细胞损伤有一定的保护作用，推测其可能通过影响神经细胞内h3O2的生成和/或神经细胞的氧化代谢过程，对神经元起到保护作用。CPU0303是一类新的神经甾体化合物，而目前新药研发主要是对神经甾体及其代谢物进行结构修饰和构效关系的研究，以期找到作用专属性强，活性好、毒性低的化合物用于某些神经系统疾病，并有望在这方面取得更大的进展。

参考文献

　　1 BallezaTapia H，Pea F.Pharmacology of the intracellular pathways activated by amyloid Beta protein〔J〕.Mini Rev Med Chem，2009；9(6)：72440.

　　2 王 丹，鲁映青，于 榕.神经甾体的合成和代谢及其对神经系统作用〔J〕.中国临床药理学与治疗学，2004；9（7）：7259.

　　3 李 珂，万 琪，俞英欣，等.多奈哌齐对β淀粉样蛋白诱导PC12细胞损伤的保护作用〔J〕.中国临床康复，2004；8(1)：746.

　　4 李红枝，廖华卫，陈伟强，等.银杏叶提取物对Aβ25～35诱导的PC12细胞损伤的保护作用〔J〕.中国老年学杂志，2006；26（4）：48890.

　　5 李运曼，陈芳萍，刘国卿.天麻素抗谷氨酸和氧自由基诱导的PC12细胞损伤的研究〔J〕.中国药科大学学报，2003；34(5)：45660.