氧化还原平衡失衡与颈动脉粥样硬化

　　　　　　作者：吴彧 王丽霞 韩跃刚 原芳 卢建敏

【摘要】 　　目的 探讨氧化还原平衡失衡与颈动脉粥样硬化的关系。方法 高分辨超声技术检测颈动脉内膜厚度，以显示颈动脉粥样硬化的发展程度，并将102例拟诊颈动脉粥样硬化患者分为：颈动脉斑块形成组46例，颈动脉内膜中层增厚组32例，颈动脉内膜中层厚度正常组24例。取静脉血，测血浆还原型谷胱甘肽（GSH）与氧化型谷胱甘肽（GSSG），还原型辅酶Ⅱ（NADPH）与氧型辅酶Ⅱ（NADP+），氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）和丙二醛（MDA）浓度。计算GSH/GSSG，NADPH/NADP+的氧化还原电位。结果 随颈动脉内膜增厚(从IMT正常组组到动脉斑块组)，GSH（μmol/L）(IMT正常组：7.39±1.03，IMT增厚组：6.54±0.94，动脉斑块组:5.49±0.86)、GSH/GSSG(IMT正常组:12.12±1.83，IMT增厚组：8.60±1.47，动脉斑块组：7.22±1.18)渐次减低， GSSG（μmol/L）（IMT正常组：0.62±0.03，IMT增厚组：0.68±0.04，动脉斑块组：0.77±0.05）、GSH/GSSG氧化还原电位（mV）（IMT正常组：-145.4±3.4，IMT增厚组：-140.2±3.1，动脉斑块组：-136.2±2.3）渐次升高（P＜0.05），向氧化方向明显偏移；NADPH、NADPH/NADP+氧化还原平衡亦显示出与GSH、GSSG类似但较弱的变化；氧化应激损伤产物oxLDL（μg/L）（IMT正常组：557.3±174.8，IMT增厚组：762.9±203.5，动脉斑块组：916.9±237.4）、MDA（μmol/L）（IMT正常组：6.27±1.52，IMT增厚组：9.86±1.97，动脉斑块组：12.61±2.33）随颈动脉内膜增厚明显增加（P＜0.05）。结论 氧化还原平衡失衡、向氧化方向偏移与颈动脉粥样硬化的发生、发展可能有内在联系。

【关键词】 动脉粥样硬化；氧化还原平衡；谷胱甘肽；辅酶Ⅱ；氧化型低密度脂蛋白

　　颈动脉粥样硬化实际上是一种颈动脉内膜慢性炎症性疾病〔1〕。在颈动脉粥样硬化发病的诸多危险因子中，如胆固醇异常升高、高血压、糖尿病、吸烟、高同型半胱氨酸血症等，在分子水平的损伤机制中都有氧化应激的参与。氧化应激通过引起脂质过氧化，内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞的氧化损伤进而促进颈动脉粥样硬化的发生发展〔2〕。但机体对于氧化应激又有着非常强大的防御、拮抗机制，两者的平衡构成了机体内环境的一个重要稳态机制，被称为氧化还原平衡 〔3〕。本研究对拟诊颈动脉粥样硬化患者血浆的氧化还原平衡进行了监测，并同步进行颈部血管超声检查，确定颈动脉内膜厚度及粥样斑块的形成面积，探讨血浆的氧化还原平衡是否与颈动脉内膜的增厚及粥样斑块的形成有相关性。

　　1 资料与方法

　　1.1 对象

　　所有研究对象为2008年3月至2009年9月在河南省人民医院心内科的住院拟诊颈动脉粥样硬化患者，共102例，男57例，女45例，年龄39～82岁，平均（58.6±14.9）岁。排除严重肝、肾疾病，内分泌代谢疾病，结缔组织疾病和肿瘤。患者行颈部血管超声检查，按内膜中层厚度或斑块形成分为三组，颈动脉斑块形成组46例，颈动脉内膜中层厚度（IMT）增厚组32例，IMT正常组24例。

　　1.2 方法

　　1.2.1 超声心动图检查

　　采用SONO5500型彩色超声心动图仪，行两侧颈动脉检查，由固定专人测定，探头频率7.5 MHz。患者仰卧位，先从锁骨的内侧端横向扫查颈总动脉，然后将探头沿其行走方向向头侧移位，跨过分叉部，分别检测患者双侧颈总动脉、颈动脉分叉部、颈内动脉起始处、颈外动脉，检查内容包括：IMT，有无斑块形成及斑块形态、大小、范围、软硬度。IMT＜1.0 mm为正常，1.0～1.3 mm为IMT增厚，以内膜局限性突出管腔、内膜厚度＞1.3 mm为颈动脉斑块形成。

　　1.2.2 血标本采集、贮存

　　取研究对象清晨空腹静脉血3 ml，放入预冷肝素（187.5 U/0.3 ml）抗凝管中，试管放在冰水混合物中保存，1 h内低温（4℃）5 000 r/min，离心3 min，取500 μl血浆超低温（-30℃）保存在不锈钢洁净（EP）管中，备测还原型辅酶Ⅱ（NADPH）和氧化型辅酶Ⅱ（NADP+）。另取750 μl血浆加入10%偏磷酸750 μl，低温（4℃）5 000 r/min，离心15 min，取上清液500 μl，超低温（-30℃）保存在EP管中，备测还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）。其余血浆用以测定氧化应激产物：氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）和丙二醛（MDA）。

　　1.2.3 氧化应激产物的测定

　　oxLDL用ELISA法测定（试剂盒由上海荣盛生物有限公司提供），MDA用硫代巴比妥法检测（试剂盒由南京建成生物工程研究所提供），所有测定步骤均按说明书严格执行。GSH和GSSG样品的测定均按荧光光度法进行〔4〕（试剂盒由南京建成生物工程研究所提供）。GSH/GSSG氧化还原电位的计算按Nernst方程〔5〕：Eh=Eo+RT/2F ln〔(GSSG)/(GSH)2〕其中，R为气体常数；F为法拉第常数；E0为GSHGSSH的标准电位值，以血液pH7.4时，标准E0为-264 mV。NADPH和NADP+样品的测定也按荧光光度法进行〔4〕。NADP+和NADPH氧化还原电位的计算同上均按Nernst方程Eh = Eo+ RT/2F In〔(NADP+)/(NADPH)〕 〔5〕。

　　1.3 统计学分析

　　采用SPSS12.0统计分析软件包进行统计分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用方差分析，两组比较用q检验。

　　2 结 果

　　2.1 血浆中的GSH氧化还原平衡

　　随颈动脉内膜增厚、颈动脉斑块形成，GSH含量逐渐减少，GSSG逐渐增多，GSH/GSSG比值降低，GSH氧化还原电位升高向氧化方向偏移（P<0.05～0.01），见表1。表1 谷胱甘肽氧化还原对各指标在血浆中的含量的影响(略)

　　2.2 血浆中辅酶Ⅱ氧化还原平衡

　　NADPH/NADP+的氧化还原平衡显示出与GSH氧化还原平衡相似的变化，但不如GSH氧化还原平衡的变化明显，见表2。表2 辅酶Ⅱ氧化还原对各指标在血浆中的含量的影响(略)

　　2.3 各组氧化应激产物水平

　　随颈动脉内膜增厚、斑块形成，oxLDL、MDA逐渐增多（P＜0.05～0.01），见表3。3 各组氧化应激产物水平(略)

　　3 讨 论

　　氧化应激损伤与动脉粥样硬化发展的关系已得到广泛的认同，因此，还原性的维生素(Vit C，Vit E)已被临床用于动脉粥样硬化的治疗，但一些大样本、多中心的研究结果显示，还原性维生素对动脉粥样硬化的预防、治疗效果并不理想〔6〕。机体的氧化还原平衡是一个动态平衡，由于机体基础氧化还原平衡的差异，还原性维生素并不总能提供抗氧化保护，氧化还原反应是根据反应体系中氧化还原电势来决定电子流向的。例如Vit C，是一个典型的抗氧化剂，但一定条件下却可以生成抗坏血酸自由基，成为一个氧化增强剂〔7〕。

　　GSH/GSSG被认为是细胞中主要的氧化还原缓冲对，GSH可清除活性氧（ROS），维持生物大分子的巯基（SH）活性中心，使Vit C和Vit E维持还原状态，反应中GSH被氧化为GSSG后，在GSSG还原酶催化下，以NADPⅡ递氢，GSSG可被重新还原为GSH，遂可重复利用〔8〕。另一方面，蛋白质分子中大量的二硫键(SS)结构亦与蛋白质的功能密不可分，这需要一定的氧化态维系。因此，机体内必有一个相当恒定的GSH/GSSG氧化还原态。资料显示，不同类型的细胞中GSH/GSSG氧化还原电位非常一致，并与细胞的增殖、分化、凋亡等不同状态有关〔9〕。人血浆中氧化还原电位值比细胞内液更偏向氧化，亦维持于一个相当恒定的范围内。细胞释放的GSH和GSSG入血可直接影响血浆氧化还原电位值，并改变血浆GSH/GSSG的氧化还原态〔10〕。目前认为，血浆中GSH/GSSG可一定程度上反映机体氧化还原内稳态的改变，GSH/GSSG向氧化方向偏移时可产生类似过氧化氢增多时产生的氧化损伤效应〔11〕。辅酶Ⅱ有NADP+和NADPH两种形式，亦构成了体内另一个重要的氧化还原对，是体内许多还原酶的重要辅助因子，在许多代谢反应中发挥递氢作用，提供还原当量，可使GSSG还原为GSH，以维持GSH/GSSG正常的氧化还原平衡〔12〕。机体的氧化还原状态亦受NADPH/NADP+的调节，血浆中NADPH/NADP+含量亦是反映机体氧化还原平衡的一项重要指标。oxLDL、MDA是氧化应激损伤的产物，特别是oxLDL，被认为与动脉粥样硬化的发病有密切的关系〔13〕。本文资料显示，将颈动脉粥样硬化患者以超声心动图监测的IMT分组时，随颈动脉内膜增厚(提示动脉粥样硬化的发展)，其氧化还原平衡指标、特别是GSH/GSSG氧化还原对，显示出进行性的氧化偏移。

　　因此，本文提示，了解病人的氧化还原平衡、特别是GSH/GSSG的氧化还原平衡，纠正其偏移，可能是针对颈动脉粥样硬化发生、发展的氧化应激损伤机制的一条合理思路。

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