老年性痴呆模型大鼠海马区Bcl2、Bax的表达及七福饮的干预作用

　　　　 作者：兴桂华 李雪岩 林春荣 胡南 牛英才

【摘要】 　　目的 探讨β淀粉样蛋白(Aβ142)诱导的老年性痴呆（AD）模型大鼠Bcl2、Bax的表达及七福饮对其的干预作用。方法 采用海马立体定向注射凝聚态Aβ142制备AD大鼠实验动物模型，药物干预4 w后应用实时定量PCR法检测Bcl2 mRNA及Bax mRNA的表达。采用免疫组织化学染色和计算机图像分析技术测定海马区Bcl2、Bax蛋白阳性目标积分光密度。结果 与假手术对照组比较，模型组Bax mRNA和蛋白表达水平显著升高，而Bcl2 mRNA和蛋白表达水平显著降低。与模型组比较，盐酸多奈哌齐组、七福饮各剂量组Bax mRNA 和蛋白表达显著降低，而七福饮各剂量组Bcl2 mRNA和蛋白表达显著升高（P<0.05）。结论 大脑海马注射Aβ142后大鼠海马组织Bax 表达明显增高，Bcl2表达明显降低，七福饮可抑制海马组织Bax表达，促进Bcl2表达，为七福饮抗AD的作用机制之一。

【关键词】 老年性痴呆；七福饮；免疫组化；细胞凋亡；实时荧光定量PCR

　　研究表明，神经细胞的凋亡是 AD发生的一个重要机制〔1〕。近年研究证实，某些中药复方可通过抑制AD大鼠海马组织Bax 基因的表达和促进Bcl2基因的表达，减少神经细胞凋亡，达到抗AD的作用〔2～4〕。七福饮为传统经典名方，出自张景岳《景岳全书》，对痴呆病有一定的临床疗效〔5，6〕。本实验采用海马注射Aβ142诱导AD大鼠模型，通过实时定量PCR和免疫组化法检测凋亡相关基因Bax和Bcl2表达，并观察七福饮的干预作用，为七福饮临床治疗AD提供理论佐证。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验药物

　　七福饮饮片购自齐齐哈尔市药材公司中药饮片厂长春堂药店。采用水提醇法制备七福饮浓缩液：七福饮饮片加6倍量蒸馏水煎煮2次，每次1.5 h，合并滤液，滤过滤液浓缩至相对浓度1.2（50℃～60℃）；加入乙醇使醇含量达65%，冷藏24 h，醇液滤过，滤液回收乙醇，至无醇味；合并药液滤过；滤液冷藏放置，视无沉淀析出；添加蒸馏水，调pH值至6.5～7.0，并调整至相当于含生药2 g/ml；精滤、灌封、灭菌即得。盐酸多奈哌齐片由法国PFIZER PGM公司制造，产品批号5136903。Aβ142为北京中杉金桥生物技术有限公司产品，使用前用无菌生理盐水稀释成10 μg/μl，37℃孵育1 w，使其变为聚集状态的Aβ。

　　1.2 实验动物

　　健康雄性清洁级SD大鼠84只购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号SCXK（京）20020003，体重(280±10) g，适应性饲养1 w，随机分为7组：空白对照组、假手术对照组、模型组、盐酸多奈哌齐组和3个剂量七福饮组，每组12只。

　　1.3 主要试剂及仪器

　　荧光定量PCR试剂盒（SYBR）及Total RNA提取试剂均为TAKARA公司产品，焦碳酸二乙酯（DEPC）为瑞兴化学产品。兔antiBcl2、总antiBax抗体购于武汉博士德生物工程有限公司，即用型免疫组化染色（SP）试剂盒及二氨基联苯胺（DAB）显色剂均购于福州迈新生物技术公司。ABI7300荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品，2700型PCR System扩增仪为Applied Biosystems公司产品。UV2550型紫外分光光度计为日本岛津产品。

　　1.4 方法

　　1.4.1 动物模型的制备〔7〕

　　实验大鼠1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后，立体定位仪固定头部，备皮消毒，沿颅顶中线作2 cm切口，分离骨膜使头骨暴露，于前囟向后3.0 mm，中线左右各旁开2.2 mm，用牙科钻打开颅骨，垂直进微量进样器2.8 mm，将1 μl溶液缓慢注入，注射时间5 min，留针5 min，模型组、盐酸多奈哌齐组、七福饮各剂量组左右侧海马各注射1 μl Aβ142(10 μg)溶液，假手术对照组注射1 μl生理盐水。

　　1.4.2 药物干预

　　造模后3 d开始给药，根据人和动物按体表面积折算等效剂量。盐酸多奈哌齐组按0.33 mg/kg，1次/d灌胃，各实验组分别按2.15、4.3和8.6 mg·kg-1·d-1剂量给药，其余3组给等体积生理盐水，共4 w后处死大鼠取材。

　　1.4.3 荧光实时定量PCR检测大鼠大脑海马组织Bcl2、Bax mRNA表达

　　按RNAiso Reagent操作说明书提取大鼠右侧海马组织总RNA，紫外分光光度计分析及琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的纯度、浓度及完整性。

　　逆转录反应在2700型PCR系统扩增仪上按SYBR ExScriptTM RTPCR Kit反转录反应试剂盒方法操作，反应参数如下：反转录反应42℃ 15 min，反转录酶失活反应95℃ 2 min。

　　PCR反应引物由TAKARA公司设计合成，序列如下：Bcl2：上游5′TGAACCGGCATCTGCACAC3′；下游5′CGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG3′。Bax：上游5′AGACACCTGAGCTGACCTTGGAG3′；下游5′GTTGAAGTTGCCATCAGCAAACA3′。GAPDH：上游5′GACAACTTTGGCATCGTGGA3′；下游5′ATGCAGGGATGATGTTCTGG3′。反应条件如下：预变性95℃ 10 s，1个循环；95℃ 5 s，60℃ 31 s，40个循环。反应结束后，使用Sequence Detection software version 1.2.3 软件（Applied Biosystems公司）分析PCR过程每个检测样本的Ct值。

　　1.4.4 免疫组化检测Bcl2、Bax蛋白的表达

　　大鼠断头去脑，脑组织用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，厚约4 μm。采用SP法进行染色，切片常规脱蜡至水，3% h3O2室温25 min灭活内源性过氧化物酶，微波炉加热进行抗原修复。用5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液室温封闭20 min，滴加的兔antiBcl2 (稀释度1∶150)或兔antiBax (稀释度1∶150)，4℃冰箱过夜，滴加生物素化山羊抗兔IgG 37℃ 20 min，滴加链酶卵蛋白37℃孵育20 min，DAB显色，苏木素复染细胞核，以上各步骤均用0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min。显色后常规脱水、透明、中性树胶封片，光镜下观察，棕色着色处为阳性。用PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性片作阳性对照，其他步骤相同。采用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统对大脑海马Bcl2、Bax阳性细胞测量分析每个统计场的积分光密度，每组6只大鼠，每张切片观察5个视野。

　　1.5 统计学处理

　　采用SPSS13.0软件包，计量数据以x±s表示。多组间分析用单因素方差分析，组间两两比较用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 七福饮对AD模型大鼠海马组织Bcl2 mRNA表达的影响

　　分别扩增GAPGH和Bcl2，每样本作2复孔，得到两组阈循环值（Ct）平均值。通过2-△△CT计算Bcl2相对mRNA表达水平，△CTintervention=CTintervention bcl2-CTintervention GAPDH，△CTblank=CTblank bcl2-CTblank GAPDH，△△CT=△CTintervention-△CTblank，Bcl2 mRNA表达差别倍数以2-△△CT表示。见表1。模型组Bcl2 2-ΔΔCt显著低于假手术对照组（P<0.01），表明模型组Bcl2 mRNA表达下调；与模型组比较，盐酸多奈哌齐组、七福饮3个组别2-ΔΔCt显著升高，表明Bcl2 mRNA表达上调。与盐酸多奈哌齐组比较，4.3、8.6 mg·kg-1·d-1七福饮组2-ΔΔCt值明显升高(P<0.05)，表明七福饮中、高剂量组疗效优于盐酸多奈哌齐。表1 各组AD模型大鼠海马组织Bcl2 mRNA的表达(略)

　　2.2 七福饮对AD模型大鼠海马组织Bax mRNA表达的影响

　　分别扩增GAPGH和Bax，每样本作2复孔，得到两组Ct平均值。Bax mRNA表达差别倍数以2△△CT表示，方法同2.1。见表2。模型组Bax 2-ΔΔCt显著高于假手术对照组（P<0.01），表明模型组Bax mRNA表达上调；与模型组比较，盐酸多奈哌齐组、七福饮3个组别2-ΔΔCt均明显减少，表明Bax mRNA表达下调。与盐酸多奈哌齐组比较，七福饮3个组别2-ΔΔCt值均明显减少，但仅高剂量组有统计学意义(P<0.05)，表明七福饮高剂量组作用效果优于盐酸多奈哌齐组。表2 各组AD模型大鼠海马组织Bax mRNA的表达(略)

　　2.3 七福饮对AD模型大鼠海马组织Bcl2、Bax蛋白表达的影响

　　见表3。表3 各组AD模型大鼠海马组织Bcl2、Bax蛋白的表达(略)

　　3 讨 论

　　研究表明，Aβ引起神经细胞凋亡导致AD患者脑内神经细胞和突触丢失，最后引起痴呆〔8〕。因此，Aβ诱发的神经细胞凋亡可能是AD认知功能障碍的主要病理基础。细胞凋亡不仅为机体维持正常生理所必需，而且是许多疾病的发病机制。凋亡途径主要分为内源性和外源性途径，即死亡受体途径和线粒体途径。凋亡启动因子Aβ可诱导线粒体的功能缺陷引发外源性途径凋亡。Bcl2家族为外源性凋亡途径的调节分子，在细胞凋亡中发挥着重要作用，其中Bcl2、Bax是一对参与调节细胞凋亡过程的细胞因子。Bax作为促细胞凋亡分子，可结合成BaxBax同源二聚体，构成线粒体膜上离子通道的成分，通过改变线粒体通透性，使细胞色素C穿过线粒体膜，释放细胞色素C，启动与caspase相关的凋亡反应，导致线粒体依赖型凋亡的发生〔9，10〕。Bcl2也主要是通过线粒体途径对细胞凋亡进行调节，尤其在细胞色素C的释放调控中起重要作用〔11〕。Bcl2结合到线粒体膜，与Bax竞争结合形成Bcl2Bax异源二聚体，关闭线粒体膜通透性转变孔，阻碍细胞色素C的释放，从而抑制细胞凋亡〔12，13〕。此外，Bcl2还可阻止线粒体释放 caspase3，并抑制其合成。
　　
　　由于AD病因、机制仍尚未明确，现代医学临床上无特殊有效疗法和药物。中医学经长期的临床和实验研究对AD的病因、病机有其独特的认识。本实验通过实时定量PCR检测发现，模型组Bax 2-ΔΔCt较假手术对照组显著升高，而Bcl2 2-ΔΔCt显著降低；七福饮各剂量组与模型组比较，Bax 2-ΔΔCt显著减少、Bcl2 2-ΔΔCt显著升高。通过免疫组化检测Bax 、Bcl2蛋白表达还发现，与假手术对照组比较，模型组Bax蛋白积分光密度显著增加，Bcl2显著减少；与模型组比较，七福饮各剂量组Bax蛋白积分光密度明显减少，Bcl2明显增加。表明大脑海马注射Aβ142后大鼠海马组织Bax表达水平明显增高，Bcl2表达水平明显降低，提示抗细胞凋亡作用减弱，促细胞凋亡作用增强，推测诱导神经细胞凋亡是Aβ的神经毒性作用在病理形态学的改变之一。而七福饮各剂量组Bcl2表达上调，Bax表达下调，提示七福饮可调节凋亡相关蛋白，进而阻碍线粒体释放细胞色素Ｃ，通过线粒体途径来抑制Aβ诱导的神经细胞凋亡，这可能为七福饮治疗AD的作用机制之一。

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