胱抑素C基因G82C与冠心病的关系

　　　　　　作者：徐向红 居军 郭进京 李永红

【摘要】 　　目的 探讨胱抑素C(cystatin C，Cys C)基因5′端82G/C突变与中国甘肃地区汉族人冠心病（CHD）、2型糖尿病（T2DM）合并CHD(T2DM+CHD）是否存在关联。方法 运用PCR限制性片段长度多态性（RFLP）分析方法，对120例无亲缘关系之中国甘肃汉族人(正常对照组40例、CHD组40例、T2DM+CHD组40例)中对Cys C基因变异进行检测。结果 CHD组中GC、CC和GG基因型频率分别为38.24%、2.94%和58.82%；T2DM中GC、CC和GG基因型频率分别为44.12%、2.94%和52.94%;正常对照者组中GC、CC和GG基因型频率分别为30.0%、5.0%和65.0%；G等位基因频率在CHD组、T2DM+CHD组和正常对照者组中分别为77.94%、75.0%和80.0%。基因型频率和等位基因频率在组间无统计学差异。结论 在中国甘肃汉族人群中存在Cys C基因5′端82G/C变异的多态性，Cys C基因多肽位点可能不是中国甘肃汉族人CHD及T2DM的遗传影响因素。

【关键词】 胱抑素C;等位基因频率;冠心病

　　遗传因素在冠心病的发生、发展中起着非常重要的作用。近年的研究提示胱抑素C（cystatin C，Cys C）与组织蛋白酶等相互作用，参与了动脉粥样硬化(AS)性疾病的病理过程。Cys C基因突变其频率分布受人种、地域等因素的影响较大，并且其多态性与冠心病（CHD）的关系目前国内外研究结果尚不一致。本研究采用病例对照研究，通过对80例CHD患者和40名健康人的Cys C、高敏C反应蛋白（hsCRP）、白介素6（IL6）、血脂与血糖水平进行检测，选取Cys C基因启动子区域的单核苷酸多态性位点(G82C)，采用PCR限制性片段长度多态性（RFLP）技术进行基因分型，了解Cys C基因多态性与CHD的相关性，以期探讨在CHD发生中的检测价值。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象

　　对照组系甘肃省人民医院体检中心选取的健康人40名，男21名，女19名，年龄37～72岁。病例组（T2DM）80例，男41例，女39例，年龄42～89岁之间，其中CHD40例，2型糖尿病（T2DM）合并CHD（T2DM+CHD）组40例。CHD的诊断标准符合冠脉造影检查证实至少一支冠脉狭窄≥50%或既往有明确的心肌梗死史者，无合并糖尿病史；T2DM+CHD为因CHD住院的T2DM患者，来于甘肃省人民医院心内科、干部病房3科、内分泌科同期住院病人。

　　1.2 方法

　　采集周围静脉血2 ml，乙二胺四乙酸二钠(EDTA)抗凝，基因组DNA用碘化钠法提取。引物参照文献〔1〕序列并由上海生工生物公司合成。引物：F82：5′GATGGATGGGGAAGGACAG′3，R82:5′CAGGATGGCCAGCAGGAG3′，取3 μl PCR产物经2％琼脂糖电泳观察电泳条带分子量大小，扩增长度为379 bp。扩增产物用限制性内切酶SacⅡ 10 U，37℃消化3 h，酶切产物经2％琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色30 min后在紫外灯下判定基因型。基因型分别为82G/G(179、200 bp)，C/C纯合型(379 bp)，82G/C杂合型(379、179和200 bp)。

　　1.3 统计学处理

　　所有数据以SPSS10.0统计软件进行处理。计量资料比较用方差分析，计数资料比较用χ2检验，HardyWeinberg平衡用χ拟合优度检验计算，关联程度用相对危险度OR及其95％可信区间(CI)表示。率的比较采用卡方检验，两组间均数的比较采用t检验。Pearson χ2检验用于比较组间基因型和等位基因的分布。

　　2 结 果

　　2.1 临床资料

　　病例组和对照组相比，CHD患者合并高血压、吸烟者较多，CHD组及T2DM+CHD组的体重指数（BMI)、hsCRP、IL6、总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白（LDL）、血糖(Glu)等指标与对照组相比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）。见表1。表1 两组的临床资料(略)

　　2.2 Cys C基因多态性与CHD的关系

　　病例组和对照组基因型分布均符合HardyWeinberg平衡。-82G/C正常对照人群中的GC、CC、GG型分别为30.0％、5.0％、65.0％，-82G/C病例组中的GC、CC、GG型分别41.18％、2.94％、55.88％。Cys C基因多态性与CHD相关性分析如表2所示。病例组与对照组基因型频率和等位基因频率分布无显著性差异(P＞0.05)，CHD组和T2DM+CHD组与对照组基因型频率和等位基因频率分布也无显著性差异(P＞0.05)。表2 Cys C等位基因频率和基因型频率的分布〔n(略)〕

　　3 讨论

　　各种促炎因子如IL1、IL6、CRP、hsCRP等所形成的炎性因子调节网络在AS发生、发展过程中可能起主要作用〔2〕。Haddy等通过队列研究调查认为，在健康家庭人群中，IL6的水平是AS的一个危险因素〔3，4〕。本研究也证实了这一点，与对照组相比CHD组BMI、hsCRP、IL6、TG、HDL等指标差别具有统计学意义，与对照组相比T2DM+CHD组BMI、hsCRP、IL6、TC、HDL、Glu等指标差别具有统计学意义，说明BMI、hsCRP、IL6、TG、HDL是AS的相关危险因素。
　　
　　Cys C广泛存在于动植物组织和体液中，能与木瓜蛋白酶、组织蛋白酶等胱抑素酶形成紧密的复合物，抑制他们的活性，从而保护蛋白质的二硫键不被胱抑素酶破坏，阻止蛋白的降解。研究表明胱抑素酶抑制剂具有很好的生物防御作用，对肿瘤转移〔5〕、病毒的感染都有抑制作用〔6〕，在细胞程序性死亡中也起重要的调节作用。随着Cys C研究的深入，发现Cys C可能与某些具有遗传倾向的疾病有关，因此对血清Cys C水平的检测已不能满足于临床，进而从分子水平对Cys C基因多态性进行研究。Crawford等〔7〕通过应用PCRRFLP技术对Cys C基因第1外显子+73A／G变异进行了分子筛查，研究了它与老年性痴呆的关系，为Cys C的基因检测开辟了道路。Michael等〔8〕通过大样本的前瞻性队列研究发现，在CHD患者中Cys C的某些基因型多态性与患者血浆中Cys C的浓度高度相关。基因发生突变可能引起Cys C的合成和分泌量降低，对Cys C酶活性的抑制功能也可能减弱，大量的淀粉样物质积聚于体内。本文研究结果显示，中国甘肃汉族人群中确实存在Cys C82G/C位点的多态性，但等位基因频率和基因型频率在正常人群中和病例组中相比无统计学差异。由此推测Cys C基因启动子区82G/C多态性与CHD和T2DM合并CHD均没有关联关系，表明Cys C82G/C的基因多态性可能不是CHD、T2DM合并CHD的遗传影响因素。然而冠心病是多因素疾病，Cys C基因多态性与冠心病的关系；基因与环境，基因与基因之间的相互作用是否对冠心病有确切影响还应综合考虑样本量、样本构成、研究方法、人种以及地理差异等方面因素进行进一步的综合分析。随着Cys C基因多态性与CHD的大样本、多地域、多民族广泛深入的协同研究，结合相关危险因素指标（IL6、hsCRP、CRP等）将有可能为冠心病的风险预测、预防和治疗提供一条新的线索和途径。

参考文献

　　1 Eriksson P，Deguchi H，Samnegrd A，et al.Human evidence that the cystatin C gene is implicated in focal progression of coronary artery disease〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004;24(3):5517.

　　2 Bickel C，Rupprecht HJ，Blankenberg S，et al.Relation of markers of inflammation (Creactive protein，fibrinogen，von Willebrand factor，and leukocyte count) and statin therapy to longterm mortality in patients with angiographically proven coronary artery disease〔J〕.Am J Cardio1，2002;89(8):9018.

　　3 Bennet AM，Prince JA.Fei GZh，et al.Interleukin6 serum levels and genotypes influence the risk for myocardial infarction〔J〕. Atherosclerosis，2003;171(2):35967.

　　4 Haddy N，Sass C，Droesch S，et al.IL6，TNFalpha and atherosclerosis risk indicators in a healthy family population：the STANISLAS cohort〔J〕. Atherosclerosis，2003；170(2):27783.

　　5 Sexton PS，Cox JL．Inhibition of motility and invasion of B16 melanoma by the overexpresion of cystatin C〔J〕.Melanoma Res，1997;7(2):97101.

　　6 Argos P，Kamer G，Nicklin MJH，et al.Similarity in gene organization and homology between proteins of animal picornaviruses and a plant comovirus suggest commnon ancestry of these virus families〔J〕.Nucleic Acid Res，1984;12(18):725167.

　　7 Crawford FC，Freeman MJ，Schinka JA，et al.A polymorphism in the cystatin C gene is novel risk factor for lateonset Alzheimers disease〔J〕. Neurology，2000;55(6):7638．

　　8 Michael L，Loem M，Hoffmann MM，et al.Genotype and plasma concentration of cystatin C in patients with coronary heart disease and risk for secondary cardiovascular events〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005;25(7):14704.