50 mg/kg剂量左旋多巴对帕金森病大鼠神经行为学和超微结构的影响

　　　　　　作者：何建成 王文武 丁宏娟 王慧

【摘要】 目的 观察50 mg/kg剂量左旋多巴(Ldopa)对帕金森病（PD）大鼠神经行为学和超微结构的影响。方法 采用脑部偏侧注射6羟基多巴胺（6OHDA）制备PD模型，进一步腹腔注射50 mg／kg剂量Ldopa，连续4 w。每周观察2次行为学〔异常不自主动作(AIM)评分、对侧旋转行为的评定〕，并进行阿扑吗啡（apomorphine，APO）诱导PD大鼠对侧旋转行为的评定。实验结束后行心脏灌注固定，分离双侧黑质、纹状体，进行透射电镜观察。结果 模型大鼠对APO诱导的旋转圈数、AIM评分、大鼠旋转启动时间，在2、3、4 w中，差异无统计学意义（P＞0.05）。旋转持续时间、药效期平均旋转圈数、剂峰旋转圈数，虽有增加的趋势，但仅与第3天比较，差异有统计学意义（P<0.05）。大鼠注射侧（右侧）黑质、纹状体出现细胞膜皱缩，细胞体积缩小，线粒体嵴部分溶解，细胞核皱缩或不规则，核膜部分不完整等。结论 50 mg/kg Ldopa对PD大鼠具有明显的神经毒性，有典型的神经行为学改变和超微结构改变。模型稳定，可用于后续研究。

【关键词】 左旋多巴；帕金森病；模型；神经行为学；超微结构

　　【Abstract】Objective To observe the effect of 50 mg/kg Ldihydroxyphenylalanine (Ldopa) on neuroethology and ultra microstructure of rats with Parkinson′s disease (PD). Methods The unilateral PD model was made by injecting 6OHDA/Benserazide into the right substantia nigra. The successful PD models were applied with 50 mg/kg Ldopa intraperitoneal injection for 4 w. Neuroethology was observed twice a week grading of abnormal involuntary movement(AIM) and evaluation of contralateral rotation] and the evaluation of contralateral rotation was done on rats with PD induced by apomorphine(APO). After experiment， perfusion fixation was used on rats and substantia nigra and corpus striatum were separated for a study of transmission electron microscopy. Results The circle count， the gradings of AIM and startup time of rotation at the time of 2， 3 and 4 w were not significantly different for the rats induced by APO（P＞0.05）. The duration of rotation， average circle count in pharmacological action and circle count of peak rotation had got the tendency of increase， but only on the 3rd day had significantly difference（P<0.05）.The substantia nigra and corpus striatum in the injected lateral (right side) were altered as evidenced by crenulated cell membrane， decreased cell volume， partly dissolved mitochondrial cristae， crenulated or irregular cell nuclear and incomplete nuclear membrane.Conclusions 50 mg/kg Ldopa has got obvious neurotoxicity in rats with PD which caused typical changes of neuroethology and ultra microstructure. Models are stable which could be used for the consecutive study.

　　【Key words】Ldihydroxyphenylalanine；Parkinson′s disease；Models；Neuroethology；Ultra microstructure

　　帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是以震颤、肌强直、运动减少和姿势异常为特征的慢性神经系统变性疾病。由于多巴胺（PD）的主要病理改变为黑质纹状体DA含量的减少，左旋多巴(Ldihydroxyphenylalanine，Ldopa)作为DA的前体通过代谢后成为DA而减轻PD的症状。故迄今为止Ldopa仍是PD的金标准治疗药物，是目前其他治疗方法和药物所无法替代和比拟的〔1〕。但在其长期治疗中常出现诸多毒副反应。本文采用经典的6羟基多巴胺（6OHDA）致AD模型，观察50 mg/kg剂量Ldopa对PD大鼠模型神经行为学的影响，以探讨Ldopa治疗PD的效果和毒副反应，为临床应用Ldopa治疗PD和研究Ldopa毒副反应大鼠模型的制备提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 动物

　　SD大鼠，15只，SPF级，雄性，体重180～200 g，由上海中医药大学实验动物中心提供。许可证号：SYXK（沪）20040005。实验条件：动物饲养在上海中医药大学实验动物中心，恒温(20℃±2℃)，自动光暗控制(LD12∶12，即07：00～19：00 光照，19：00～07：00 暗置)，相对湿度60%～65%，动物摄食饮水自由。

　　1.1.2 药品

　　水合氯醛：分析纯，上海国药集团；Ldopa干粉、苄丝肼：美国Sigma公司产品；庆大霉素：上海第一制药厂产品。

　　1.1.3 试剂

　　6OHDA、阿扑吗啡（apomorphine，APO）、抗坏血酸(antiscorbic acid)均为美国Sigma公司产品。

　　1.1.4 仪器

　　大鼠脑立体定位仪:TOW3A型，广东汕头市教育医学仪器厂；微量进样器（5 μl）：上海第三分析仪器厂。

　　1.2 模型制备方法

　　采用Ungerstedt等〔2〕创立的方法制备PD模型。术前按常规进行行为测试，确认无异常旋转行为后，用10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉。然后将大鼠固定于脑立体定位仪上，头部去毛，苯扎溴铵(商品名：新洁尔灭)常规消毒。无菌条件下，沿正中线切开大鼠颅顶皮肤，剥离骨膜，暴露前囟。以前囟为准，根据包新民等〔3〕著大鼠脑立体定位图谱，确定右侧黑质二坐标：①前囟后5.2 mm，正中线右侧1.0 mm，硬膜下9.0 mm。②前囟后5.2 mm，正中线右侧2.5 mm，硬膜下8.5 mm。用颅骨钻于手术要求部位小心钻开颅骨，用5 μl微量进样器将6OHDA(溶于含0.02%抗坏血酸的生理盐水中，即秤量药品抗坏血酸0.001 g，溶于生理盐水0.5 ml中)注入右侧黑质部(以1.0 mm／min速度缓慢进针)，每孔3 μl，注射速度为1 μl／min，注射完毕后留针5 min，然后以1.0 mm／min速度缓慢退针。手术完成后，用医用明胶海绵填塞颅骨孔，缝合切口皮肤，肌肉注射庆大霉素7 d，待动物清醒后放回饲养笼中饲养。假手术组只注射含0.02%维生素C的等量生理盐水，其余条件与造模手术相同。正常对照组只固定大鼠，不进行任何处理。10 d后，以腹腔注射APO 0.5 mg／kg诱发大鼠向一侧旋转，记录开始旋转至30 min内的旋转圈数，以旋转圈数平均>7次／min者为合格的PD模型〔4〕。

　　1.3 Ldopa毒副反应的行为学观察

　　将造模成功大鼠于每日上午9时和下午5时行腹腔注射50 mg／kg剂量的Ldopa，配成10 mg/ml (即按50 mg／kg Ldopa和12.5 mg／kg苄丝肼溶于含0.05%乙醇和0.1%抗坏血酸的注射用水中)。连续给药4 w。每周观察2次行为学，主要有异常不自主动作(abnormal involuntary movement，AIM)评分，对侧旋转行为的评定。同时进行APO诱导PD大鼠对侧旋转行为的评定。

　　1.3.1 APO诱导大鼠对侧旋转行为的评定

　　各组大鼠均腹腔注射APO 0.5 mg/kg以诱发大鼠向对侧旋转，记录开始旋转至30 min内总的旋转圈数。

　　1.3.2 对侧旋转行为的评定

　　各组大鼠均在腹腔注射Ldopa后进行行为学观察，记录用药后每5 min的旋转圈数、Ldopa用药后旋转启动时间、剂峰旋转圈数以及旋转持续时间。

　　1.3.3 行为学观察与AIM评分

　　1.3.3.1 肢体运动障碍

　　损毁对侧前肢重、节律性的反射运动或肌肉运动障碍评分：0分，无；1分，逐渐出现的可辨别的对侧前肢反射运动；2分，间歇性高频率的对侧前肢运动；3分，持续性高频率的肌肉运动，刺激可使之停止。4分，持续性高频率的肌肉运动，刺激无法使之停止。

　　1.3.3.2 轴性运动

　　头部及躯体朝向损毁侧的侧屈及轴性旋转评分：0分，无；1分，以两足站立时躯体经常性向对侧旋转；2分，以两足站立时躯体经常性向对侧旋转同时伴有间歇性头颈侧屈；3分，持续的头颈及躯干对侧旋转，但仍可保持平衡；4分头颈及躯干强迫性抽搐，无法保持平衡。

　　1.3.3.3 咀嚼行为

　　重复性的吐舌及下颚咀嚼行为评分：0分，无；1分，偶然性的出现咀嚼运动；2分，频繁的出现咀嚼运动；3分，持续性出现小幅度地咀嚼运动；4分，强迫性大幅度重复咬噬动作并伴有频繁的吐舌行为。

　　1.3.3.4 对侧旋转

　　向损毁对侧转身或旋转评分：0分，无；1分，固定偏向一侧的转身，运动行为有可能增强；2分，间歇性稳定的对侧旋转；3分，持续性地对侧旋转，刺激可使之停止；4分，持续性的对侧旋转，刺激不可使之停止。

　　各组大鼠于治疗期间进行AIM评分，每次评定结果由经用药后每间隔35 min的AIM总分数组成，每次连续评定4组数据，持续140 min，4次评分之和为最终得分〔5〕。

　　1.4 电镜检测方法

　　每组取3只进行心脏灌注固定。先灌注生理盐水（约200 ml）至流出液体不见血色为止，接着灌注4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PBS）液（约200 ml），当动物出现四肢抽搐、四肢变硬时，表示灌注完成。分离中脑双侧黑质、纹状体，在双侧黑质、纹状体部位各切取1 mm3大小组织块5～8粒，立即用2%戊二醛和1%锇酸双重固定，系列酒精脱水，环氧树脂618包埋，切片，铅染，透射电镜观察。

　　1.5 统计学方法

　　所有资料均用x±s表示，采用SPSS13.0版软件进行齐性检验并做方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 Ldopa对APO诱导PD大鼠对侧旋转行为的影响

　　模型大鼠注射APO后0.5～5 min时，均出现了旋转行为。随着Ldopa用药时间的延长，旋转圈数一般在给药21 d时达到最高峰，之后旋转圈数有逐渐降低趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

　　2.2 Ldopa对PD大鼠AIM评分的影响

　　模型大鼠主要表现出程度不同的AIM，包括刻板动作和对侧旋转行为，前者又包括损毁对侧前肢不自主拍动(前肢AIM)、躯体和颈部不自主向对侧弯曲、扭转(轴性AIM)和不自主向对侧舔食动作(口面部AIM)，对侧旋转行为与刻板动作几乎同时发生。随Ldopa用药时间的延长，AIM评分有增加的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2，图3。

　　2.3 Ldopa对PD大鼠旋转启动时间、持续时间、药效期、药效期平均旋转圈数及剂峰旋转圈数的影响

　　Ldopa对PD大鼠旋转启动时间有增加的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）；对PD大鼠旋转持续时间有增加的趋势，与第3天比较，差异有统计学意义（P<0.05）；对PD大鼠药效期有增加的趋势，与第3天比较，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；对PD大鼠药效期平均旋转圈数与第3天比较差异有统计学意义（P<0.05）；对PD大鼠剂峰旋转圈数与第3天比较差异有统计学意义（P<0.05）。见图4～8。

　　2.4 电镜检查结果

　　模型大鼠注射侧（右侧）黑质、纹状体细胞膜出现皱缩，细胞体积缩小，胞浆减少，线粒体嵴部分溶解，有些细胞器肿胀，细胞核亦呈皱缩状态或不规则，有些核仁不清晰，电子密度明显增高，染色质凝聚成块并有边聚倾向，核膜部分不完整。对侧（左侧）超微结构基本正常，线粒体结构完整，细胞体积正常，核膜完整，电子密度中等，核仁居中。见图9。

　　3 讨 论

　　Ldopa迄今仍是PD治疗的金标准药物，然而长期治疗所表现出来的副反应如运动障碍、开关现象、剂末现象等比疾病本身更加严重〔6〕，影响了PD患者的正常生活质量。

　　在PD大鼠的行为学上，迄今APO诱发的旋转试验依然是主要的评价指标〔7〕。PD大鼠的旋转圈数常被用来反映大鼠黑质DA能神经元受损程度的指标〔8〕。APO是一种D2受体激动剂，存在于多巴胺能神经元的突触后膜。当黑质纹状体系统DA神经元减少超过80﹪时，在受体调节机制下，同侧D2受体出现上调，受体密度增加，敏感性增强，出现去神经超敏感现象，故当用APO激动D2受体时，产生了比健侧更强的DA活性，因而表现为向健侧的旋转。

　　本实验研究发现，模型大鼠注射APO后0.5～5 min时，均出现旋转行为。而且Ldopa模型大鼠的旋转圈数较单纯的PD模型大鼠明显增加，这是因为此时细胞外的Ldopa浓度升高，而残存的多巴能神经元处于超敏状态，故Ldopa的摄入可使大鼠表现为向健侧旋转〔9〕。也说明受损的黑质纹状体DA能系统易受Ldopa毒性作用的损伤〔10〕。模型大鼠发生的旋转行为，随着Ldopa用药时间的延长，旋转圈数亦有增加趋势，一般在给药21 d时达到最高峰。说明Ldopa在大鼠体内蓄积剂量越大，反映神经毒性作用的行为学变化则越严重，对黑质损伤逐渐加重，这一点与Bezard等〔11〕的观点一致。

　　已有的临床调查结果表明，约有30%～80%的PD患者经长期Ldopa治疗后可出现异动症(levodopainduced dyskinesia，LID)，并且随着疾病的加重及治疗时间的延长，其LID程度和发生频率均会增加；PD患者的LID多为单侧性发作，主要累及PD症状严重侧肢体，而且各个体间LID的易患性、LID严重程度、表现形式、发生时间等也均存在显著性差异〔12〕。近年来国内外研究表明，大鼠经长期Ldopa治疗后也会出现一些AIM，与人类LID在许多方面具有相似之处〔13〕。

　　本研究发现，模型大鼠在出现APO诱发的旋转行为的同时，还产生了向健侧旋转的行为变化，主要表现为旋转启动时间缩短、最高转速增加、旋转持续时间延长，大鼠AIM评分增加。模型大鼠表现出程度不同的AIM，包括刻板动作和对侧旋转行为，前者又包括损毁对侧前肢不自主拍动(前肢AIM)、躯体和颈部不自主向对侧弯曲、扭转(轴性AIM)和不自主向对侧舔食动作(口面部AIM)，对侧旋转行为与刻板动作几乎同时发生。本文Ldopa模型大鼠均出现了前肢、躯干和口面部刻板动作，其行为学特点与Lundblad〔14〕等的报道一致。PD大鼠旋转启动时间、最高转速、持续时间可用来评价黑质损伤程度，启动越快、转速越高、旋转持续时间越长，则黑质损伤越重〔15〕。

　　AIM开始出现以后，随Ldopa用药时间的延长，AIM评分越来越高，同时APO诱发的旋转圈数也随着用药时间的延长亦明显增加，但一般在给药21 d时达到最高峰，之后随着用药时间的延长，旋转圈数有逐渐降低趋势（但无统计学意义）。说明当刻板动作逐渐趋于严重时，对侧旋转行为则逐渐减弱。

　　各类型AIM在每只大鼠身上的表现程度虽轻重不一，但每只大鼠于每次用药后的AIM表现形式总是相对固定的，提示此模型稳定，也提示AIM评分可用于对Ldopa模型大鼠的定量分析。此研究结果与Lee 〔5〕、徐氏〔13〕等的研究结果一致。

　　电镜结果发现，模型大鼠注射侧在黑质、纹状体均有损害，如可见细胞膜皱缩，细胞体积缩小，线粒体嵴部分溶解，有些细胞器肿胀，细胞核皱缩或不规则，核膜部分不完整等，但以黑质为重。符合DA能神经元凋亡的形态学改变。

　　综合本研究结果，为50 mg/kg Ldopa对PD大鼠神经毒性在大鼠行为学方面得到了很好的体现，也有典型的超微结构改变。随着Ldopa用药时间的延长，Ldopa在大鼠体内蓄积剂量越大，反映神经毒性作用的行为学变化则越严重，主要表现为PD大鼠旋转圈数、旋转启动时间减少、最高转速、持续时间增加等。该模型比较稳定，可用于后续研究。

参考文献

　　1 刘道宽，蒋雨平，江澄川，等.锥体外系疾病〔M〕.上海:上海科学技术出版社，2000：91.

　　2 Ungerstedt U.6Hydroxydopamine induced degeneration of central monoamine neurons〔J〕.Eur J Pharmacol，1968；5(1):10710.

　　3 包新民，舒思云.大鼠脑立体定向图谱〔M〕.北京:人民卫生出版杜，1991:53.

　　4 Carman LS，Gage FH，Shults CW.Partial lesion of the substantia nigra:relation between extent of lesion and rotational behavior〔J〕.Brain Res 1991；553(2)：27583.

　　5 Lee CS，Cenei MA，Schulzer M，et al.Embryonic ventral mesencephalic grafts improve levodopainduced dyskinesia in a rat model of Parkinson′s disease〔J〕.Brain，2000;123(7):136579.

　　6 Zesiewicz TA，Sallivan KL，Hauser RA，et al.Levodopainduced dyskinesia in Parkinson′s disease:epidemiology，etiology，and treatment〔J〕.Curr Neurol Neurosci Rep，2007;7（4）:30210.

　　7 Iancu R，Mohapel P，Brundin P，et al.Behavioral characterization of a unilateral 6OHDAlesion model of Parkinson′s disease in mice〔J〕.Behav Brain Res，2005；162（1）：110.

　　8 Henderson JM，Watson S，Halliday GM，et al.Relationships between various behavioural abnormalities and nigrostriatal dopamine depletion in the unilatreal 6OHDAlesioned rat〔J〕.Behav Brain Res，2003;139(12)：10513.

　　9 Cao F，Sun S，Tong ET.Experimental study on inhibition of neuronal toxical effect of levodopa by ginkgo biloba extract on Parkinson disease in rats〔J〕.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2003；23(2)：1513.

　　10 Murer MG， RaismanVozari R，Gershanik O.Levodopa in Parkinson′s disease:neurotoxicity issue laid to rest〔J〕?Drug Saf，1999;21(5):33952.

　　11 Bezard E，Gross CE，Qin L，et al.LDOPA reverses the MPTPinduced elevation of the arrestin2 and GRK6 expression and enhanced ERK activation in monkey brain〔J〕.Neurobiol Dis，2005；18(2)：32335.

　　12 Nutt JG.Levodopainduced dyskinesia:review，observations and speculations〔J〕.Neurology，1990;40(2):3405.

　　13 徐 岩，孙圣刚，曹学兵.左旋多巴诱发异动症大鼠模型的制作及其行为学评估〔J〕.中华物理医学与康复杂志，2005;27（11）：64952.

　　14 Lundblad M，Andersson M，Winkler C，et al.Pharmacological validation of behavioural measures of akinesia and dyskinesia in a rat model of Parkinson′s disease〔J〕.Eur J Neurosci，2002;15(1):12032.

　　15 曹 非，孙圣刚，童萼塘，等.不同剂量左旋多巴对帕金森病大鼠行为学影响实验研究〔J〕.中风与神经疾病杂志，2003；20（1）：145.