溶血磷脂酸上调THP1细胞基质金属蛋白酶9的表达及活性

【摘要】 　　目的 探讨基质金属蛋白酶9(MMP9)在溶血磷脂酶(LPA)致动脉粥样硬化中的作用及机制。方法 以不同浓度LPA(0～10 μmol/L）刺激人单核细胞株THP1细胞4 h，RTPCR法测定MMP9 mRNA表达，酶谱法检测MMP9活性，Western印迹法检测核蛋白NFκB p65表达变化。结果 随着LPA剂量的增加，MMP9表达及活性，核蛋白NFκB p65表达逐渐增强，在LPA 1 μmol/L时达到最高点，然后逐渐减弱，LPA以剂量依赖的方式激活NFκB，在转录水平促进THP1细胞MMP9 mRNA表达，增强MMP9活性。结论 LPA可能通过激活NFκB，在转录水平促进THP1细胞MMP9 mRNA表达，并增强其活性，促进粥样硬化发生和发展。

【关键词】 溶血磷脂酸；THP1细胞；基质金属蛋白酶9

　　溶血磷脂酸（LPA)是一种结构简单，具有激素和生长因子样的磷脂信使。近年来研究发现，LPA具有促进动脉硬化和血栓形成的作用，因此引起极大重视〔1〕。从血小板活化、内皮细胞功能障碍、诱导与维持血管壁炎症反应，到增加斑块的不稳定性、导致斑块破裂、局部栓子形成， 进而导致脑卒中或心肌梗死等缺血事件的发生等无不与LPA密切相关。MMP9，又称明胶酶B，是MMP家族中的一个重要成员，对血管壁的基底膜和细胞外成分具有清除作用，使纤维帽崩溃影响斑块的稳定性。MMP9不仅能促进动脉粥样硬化(AS)的发展〔2〕，并且是AS斑块不稳定的主要因素〔3〕。单核巨噬细胞是参与粥样硬化的主要炎性细胞。有研究表明，LPA能活化单核细胞和T淋巴细胞，促进其表达和分泌MMPs，而后者的表达和活化是LPA导致斑块不稳定或破裂的主要因素之一〔4〕。本研究应用LPA刺激体外培养的人单核细胞株 (THP1)，观察LPA对MMP9表达及活性变化以及核因子NFκB表达变化，进一步探讨LPA在致动脉粥样硬化中的作用及机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　Trizol Reagent 为Invitrogen 产品；Taq DNA聚合酶及缓冲系统、dNTP Mix为Fermentas产品，DNA Marker和RNasin购自TaKaRa，ReverTra AceαTM First Strand cDNA Synthesls KIT为TOYOBO产品，THP1为人单核细胞株，购自BIOCHAIN公司，18∶1 LPA购自SigmaAldrich公司，MMP酶谱分析试剂盒（MMP2、MMP9)购自普利莱基因技术有限公司，细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(碧云天)。

　　1.2 细胞培养及干预试验

　　THP1细胞培养于含10％小牛血清的RPMI1640培养液中，37℃，5％CO2下生长。THP1为悬浮型生长，2～3 d换液，细胞生长至(4～6)×106／ml时及时传代。将THP1细胞无血清培养过夜，以106/孔接种于24孔培养板，分别以LPA 0、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L处理4 h后收集细胞，以RTPCR法检测MMP9 mRNA水平。酶谱法检测MMP9活性。提取细胞核蛋白以Western印迹法检测NFκB p65水平。

　　1.3 总RNA提取

　　用Trizol试剂提取细胞总RNA，按照说明书进行。将1 μl(浓度按照1 μg／μl计)总RNA反转录后行PCR。PCR扩增体系25 μl，其中含2×PCR master混合液12.5 μl，上、下游引物各0.75 μl，cDNA模板(逆转录产物)1 μl，以Biometra PCR 仪(美国，UNO II型)作热循环：预变性94℃ 3 min；循环：94℃ 45 s、54℃ 45 s、72℃45 s、共30循环。循环结束后72℃10 min。MMP9引物及内参GAPDH引物由Invitrogen公司合成，引物序列如下：MMP9上游：5′ TCCCTGGAGACCTGAGAAC3′，下游：3′TTGATGAGCCTTCTGAACGG5′，扩增片断长度为306 bp；GAPDH上游：5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′，下游：5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3′，扩增片段长度450 bp。取PCR产物各5 μl在1.0％琼脂糖凝胶中电泳(120 V恒压电泳45 min)，应用GelDoc 2000型全自动凝胶成像分析仪(BoiRad公司，美国)照相并测定每条带的光密度值，以GAPDH表达量为内对照计算并比较各组样本MMP9的相对表达量。

　　1.4 MMP9活性检测

　　采用酶谱法检测。按照蛋白抽提试剂盒操作说明抽提细胞总蛋白。取5 μl阳性混合物与试剂1(2 X SDSPAGE nonreducing buffer，普利莱基因技术有限公司，P1700)混合等体积混合，待测样品5 μl按照1∶1稀释与试剂l混合后直接上样每孔10 μl，不加热变性，以30 mA恒流电泳，溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。小心去除压缩胶层，放入干净瓶皿中以适量蒸馏水冲洗凝胶。以加入试剂4(10 ml 1×buffer A)，室温漂洗凝胶2×15 min。中间换液23次。倒掉Buffer A，加入试剂5(10 ml 1×buffer B)，室温孵育4 h。凝胶加入SDSPAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液。于扫描仪上扫描凝胶，显示调整为灰度，并分析IOD值。92 kD为MMP9，130 kD、225 kD为proMMP9）。以对照组(LPA 0 μmol/L)条带的光密度为1。同一条带上其余的与之对比，用此相对值反映酶活性的大小。

　　1.5 蛋白印迹分析

　　收集细胞，按照核蛋白抽提试剂盒操作说明(碧云天公司)抽提细胞核蛋白，蛋白浓度由BCA法检测。取50 μg蛋白样品与上样缓冲液变性行SDSPAGE电泳，电泳条件为200 V。电泳完毕后进行转膜，将电转膜置于5％的脱脂奶粉中封闭，4℃过夜，以PBST漂洗膜2～3次，于加样槽中加入NFκB p65抗体约1 ml(NFκB p65 1∶300，GAPDH 1∶10 000)，注意保证膜的所有部分同溶液接触，室温下于摇床孵育，PBST洗涤10 min，加入过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶1 000)，每个加样槽中加入二抗1 ml左右室温下于摇床孵育1 h，注意保证膜的所有部分同溶液接触。PBST洗涤后进行ECL底物化学发光，暗室曝光5～30 s，照相。阳性条带以Gel pr04.0版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD值，以GAPDH的表达量为内对照计算并比较各组样本的相对表达量。

　　1.6 统计学处理

　　每组实验重复3次，数据以x±s表示。各组间比较采用单因素方差分析(oneway ANOVA)，所有统计分析均用SPSS 16.0软件进行。

　　2 结 果

　　2.1 LPA上调THP1细胞MMP9 mRNA表达

　　LPA 0、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L刺激THP1细胞4 h后，THP1 MMP9 mRNA分别为0.057±0.004，0.085±0.005，0.106±0.007，0.140±0.005，0.118±0.003，0.105±0.005，各组间差异有统计学意义(P＜0.05)。LPA以剂量依赖的方式诱导THP1细胞MMP9 mRNA表达水平增高，在LPA 1 μmol/L时表达水平最高，与其余各组相比，差异显著（P<0.01），见图1。

　　2.2 LPA对THP1细胞MMP9活性的影响

　　不同浓度LPA刺激THP1细胞4 h后，THP1细胞MMP9活性与基础水平对照组(LPA，1 μmol/L)相比，以剂量依赖的方式增加。LPA 0.1、0.5、1.5、10 μmol/L时，MMP9活性分别为对照组(1.16±0.35)、(1.37±0.03)、(1.63±0.04)、(1.38±0.02)、(1.29±0.01)倍(P＜0.05）， LPA 1 μmol/L时活性最强，与其余各组相比，差异有显著性（P<0.01)，与MMP9 mRNA表达水平一致。

　　2.3 LPA诱导THP1细胞NFκB p65活化

　　Western印迹结果显示，不同浓度LPA刺激THP1细胞4 h后，在LPA以剂量依赖方式激活NFκB p65，核蛋白NFκB p65表达水平增加，在1 μmol/L活性最强(LPA 0、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L时，THP1细胞核蛋白NFκB p65吸光度比值分别为0.25±0.01，0.31±0.01，0.43±0.01，0.58±0.02，0.45±0.02，0.44±0.02，组间差异有显著性(P＜0.05)。

　　3 讨 论

　　MMP9可由中性粒细胞，单核巨噬细胞，血管内皮细胞等多种细胞合成并以无活性酶原形式分泌，通过纤溶酶等水解而活化，其作用底物包括明胶Ⅳ、V型明胶原、弹性蛋白等。病理情况下潜在型MMP9被激活，表达上调，主要通过血管中膜平滑肌细胞迁移、增殖、凋亡〔5～7〕及细胞外基质的重塑〔8〕。MMP9主要通过粥样斑块基底膜和纤维帽的重要成分V型胶原的降解、中膜平滑肌细跑向内膜迁移，加速AS进程并导致不稳定斑块的形成〔8〕。MMP9过度表达在血管重构中起到重要作用，通过降解细胞外基质，增大管径、内膜面积及细胞核密度，为斑块的生长提供空问，当这种过程达到极点，无法阻止时，可导致斑块破裂。我们在此前的研究中发现，颈部存在不稳定斑块的脑梗死患者血清MMP9浓度显著增高〔9〕，并且MMP9在不稳定冠状动脉粥样斑块的表达显著高于稳定斑块组〔10〕，表明MMP9是形成不稳定性斑块的一个重要促进因素。

　　 LPA积聚在粥样斑块内膜处，并且在斑块脂质核心处含量最高〔11〕。大鼠粥样硬化斑块模型中，LPA和MMP9水平均显著升高，二者呈正相关〔12〕。本研究发现，LPA以剂量依赖的方式上调THP1细胞MMP9 mRNA表达，并相应促进其活性增加。同时激活NFκB p65，促使核蛋白NFκB p65表达水平增加。MMP9的调节主要通过基因转录、酶原激活及MMP生理性抑制物(TIMP1)3个水平实现，其转录水平的调节可能通过转录因子活化蛋白I(Ap1)和核转录因子NFκB途径实现。

　　NFκB为一组转录调节因子，通常以二聚体形式与其抑制蛋白Ⅰ κB结合存在于细胞浆中。当细胞受到各种刺激(包括细胞因子、缺氧、病毒、细菌感染等)后，Ⅰ κB磷酸化，从而使NFκB活化，由胞浆转移到细胞核内，与基因操纵子的NFκB特异性位点结合，启动基因转录。因此，LPA可能通过激活NFκB，在转录水平促进THP1细胞MMP9 mRNA表达，并增强其活性，促进AS发生发展以及不稳定斑块的形成，从而促使血管事件的发生。针对LPA增强MMP9活性的机制和意义进一步深入研究对于防治AS，稳定斑块，减少血管事件的发生有可能提供新的方向和线索。

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