组织蛋白酶与动脉硬化的关系

【关键词】 动脉硬化;组织蛋白酶

组织蛋白酶(cathepsin，cat)是溶酶体内的蛋白水解酶，根据其活性部位所含的氨基酸的不同，cat可以分为丝氨酸cat(如cat A和G)、天冬氨酸cat(如cat D和E)和半胱氨酸cat(CC)。其中，CC属于蛋白酶clan CA中的木瓜蛋白酶家族(C1)〔1〕。在半胱氨酸蛋白酶家族的成员中，cat B、C、F、H、O和Z在大多数组织中均有表达。尽管分布的范围很广，某些特殊的组织细胞中某些酶有更高的含量。

　　1 结构及活性调控

　　纯化的cat通常由二硫键连接的重链与轻链构成。除了四聚体的cat C以外，其他都是30 kD的单体。木瓜蛋白酶样酶类有两个结构域，在这两个域的交接点有V型活化位点。溶酶体CC的活性可通过多种方式调节，其中最重要的是酶原的激活及抑制内源性蛋白酶抑制剂(Cystatins)，与其他的蛋白水解酶相似，cat以无活性的前体的形式被合成，通过去除N端的前肽而被激活。

　　2 组织蛋白酶的生理功能

　　2.1 抗原递呈 MHC Ⅱ类分子递呈多种内吞蛋白水解产生的抗原肽到CD4+细胞。恒定链(Ii)在MHCⅡ分子的加工过程中扮演着重要角色。cat通过两种途径参与MHCⅡ的抗原呈递过程：即降解内吞的抗原蛋白和恒定链Ii的加工处理〔1〕。文献报道，早期体外研究证明CC B、L、S和天冬氨酸cat D和E参与恒定链的降解及外源性蛋白递呈，cat B和D缺陷的小鼠证实这两种酶在恒定链降解及内源性及外源性蛋白递呈中作用，但是，cat L和S缺陷的小鼠会导致MHC Ⅱ类分子成熟缺陷，cat L通过不完全恒定链的降解特异性参与MHC Ⅱ类分子的递呈，这一过程在皮质胸腺上皮细胞而不是在骨髓源性抗原递呈细胞中，在大多数细胞类型中，cat在恒定链加工中表现为重要的作用，catS缺陷的小鼠无法处理恒定链超过10 kD的片段，cat S恒定链的降解证实了一种选择性cat S不可逆抑制剂LHVS和蛋白抑制剂 cystatin C，结果表明在脾和树突状细胞中，cat是一个很大的恒定链加工酶，在B细胞中有成熟的cat L但在树突状细胞中探测不到有活性的酶〔2〕。这些表明cat L的活性在这些细胞中可能被cat L的特异性抑制剂调控，在中性和弱碱性pH值环境下，通过P41恒定链合成的cat稳定，在骨髓源性抗原递呈细胞中，缺乏p41恒定链，cat L的水平大大减低。

　　2.2 细胞凋亡 凋亡又称程序性细胞死亡，是通过一个细胞自杀过程的启动而开始的，这一启动的过程受到许多不同的细胞内和细胞外事件所调节，在凋亡过程中，细胞是通过蛋白水解酶和内切酶的活化和作用而被降解的，凋亡分为两个不同的路径，即内源性路径或称线粒体途径及涉及死亡受体的外源性路径，两种途径都涉及半胱氨酸天冬氨酸酶(caspase)〔3〕。cat主要通过内源性途径诱导细胞凋亡，通过Bid触发线粒体释放细胞色素C间接激活caspase引发凋亡，具体体途径为cat B能够切开Bid暴露其活性部位BH3，后者使线粒体膜内外电位值下降，线粒体释放细胞色素C，并且在dATP存在的条件下与胞浆中的凋亡激活因子1(Apaf1)及caspase 9酶原形式结合形成凋亡复合物，最终激活caspase3和caspase7，启动凋亡过程〔4〕。越来越多的证据证明，蛋白水解酶如溶酶体cat B、D、L，而不是caspases参与细胞的凋亡。

　　2.3 基质降解 Cat在蛋白降解中起重要作用，除溶酶体外，依据细胞类型和细胞微环境，cat 可在多处分布并发挥功能cat K、L和S是己知的最有效的弹性蛋白酶，在体外，cat B可以降解N和V型胶原及纤维连接蛋白。cat L、S和K可降解原纤维胶原，纤维连接蛋白和层黏连蛋白。DPPI可剪切纤维连接蛋白，Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型胶原。在体内，蛋白水解酶必须在能保持其活性的微环境中接触到基质分子才能发挥其基质降解活性。在胞内，它们可降解吞噬的基质分子或者分泌到胞外进行降解。除基质降解外，还参与生长因子、血管增殖调节及协助其他细胞因子调节等，有助于细胞迁移、增殖及凋亡等的调节〔5〕。CatD 降解细胞内蛋白，在前列腺癌细胞中，它是可分泌蛋白酶，可产生血管抑素(angiostatin);在肿瘤组织中，cat B、D、H、L重新分布并高表达，提示cat在肿瘤浸润、转移中起作用。由于cat广泛的底物特异性，可对许多分子进行修饰、加工，使它们活化、失活，发挥重要的作用。

　　3 cat在动脉硬化(AS)中的作用

　　3.1 cat在AS中的表达 在载脂蛋白E基因敲除的小鼠动脉硬化模型中cat B、L、F的mRNA和蛋白水平表达增加，而且证实在AS的官腔旁及巨噬细胞中的阳性率最高。但在正常动脉中仅有微量表达。早在1998年，Sukhova等〔6〕就发现cat K存在于人As病变中，而正常血管中cat K表达很少;早期AS斑块中cat K主要表达于内膜和中膜的平滑肌细胞;进展的粥样斑块中，cat K主要定位于纤维帽的巨噬细胞和平滑肌细胞中。研究〔7〕进一步指出，cat K存在于多种细胞如巨噬细胞、平滑肌细胞和内皮细胞中;其mRNA和蛋白表达水平在进展的粥样斑块中表达最高，其次为含有血栓的粥样斑块，早期AS病变最低，但仍高于正常血管。Cat S是在AS中描述的最广泛的蛋白酶。其在AS中的表达位置与cat K相似。而且发现血管腔的内皮细胞和微血管斑块也表达catS。与正常血管相比，catS mRNA和蛋白在AS内膜中表达水平增加〔8〕。这结果表明cat参与AS的形成。

　　3.2 cat与ECM重塑及斑块稳定性的关系 在LDL受体缺陷的小鼠模型中，缺乏catS可减少AS斑块面积，减慢斑块期的发展，减少弹性蛋白破裂的数量和弹性蛋白的活性。缺乏catS可导致平滑肌细胞、胶原含量、纤维帽厚度减少〔9〕。而且catS的表达与弹性蛋白碎片在巨噬细胞的同一位置。这些数据表明，catS抑制剂通过减少细胞外基质成分的降解作用对AS起保护作用。在载脂蛋白E基因敲除的小鼠中，缺乏catK可导致胶原含量和巨噬细胞面积增加，弹性蛋白裂解和巨噬细胞含量减少，但T细胞含量和脂质核面积不变。研究发现缺乏cat K改变斑块性状的现象不仅由于蛋白水解活性降低，还与激活转化生长因子β(TGFβ)信号通路有关，电镜分析发现cat K基因缺失的载脂蛋白E/小鼠斑块中的胶原成份增加。胶原增加不表现为血管平滑肌成份的增加，而是基质更新和TGF信号通路多个相关基因的表达上调。这提示cat K缺乏增加斑块纤维化不仅通过降低蛋白水解酶活性，还与激活基质更新和TGF信号通路的相关基因有关〔10〕。这些数据表明catK缺乏通过增加纤维化对AS可能有保护作用。cat K、S和V具有同等的促弹性组织离解活性，细胞因子刺激的平滑肌细胞也表明具有促弹性组织离解活性，选择性catS抑制剂或半胱氨酸蛋白酶抑制剂(E64)能抑制80%的活性〔11〕。cat S通过弹性组织裂解展现其在AS病变区的作用，cat S除表现为促弹性组织离解活性，还表现出溶胶原活性。Cat L在平滑肌细胞、内皮细胞内通过刺激碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)使促弹性组织离解活性和I型溶胶原活性增加〔12〕。Cat K不仅有助于弹性蛋白离解而且在降解I型胶原中起重要作用，因此catK具有独特的溶胶原活性。表明cat在AS的发生、发展及斑块不稳定性中也起一定作用。这些表明cat抑制剂对AS有保护作用，可能指导AS治疗。

　　4 cat与剪切应力的关系

　　在AS的初始阶段，剪应力使内皮细胞对脂质渗透性增加，使内皮细胞表达黏附分子，促使白细胞迁移至血管壁。震荡剪切应力与致AS区域有关，层剪切应力与AS保护区域有关。最近的研究证明，分泌catL是剪切应力依赖的基质蛋白酶。受抑制的cat L抑制震荡剪切应力诱导小鼠主动脉内皮细胞的明胶酶和弹性蛋白酶活性，而对层剪应力诱导的活性无作用〔13〕这表明cat L是剪应力敏感的蛋白酶，在血管重塑和动脉硬化中有重要作用。同样的研究还表明，catK同样受剪切应力的调节，高振荡切应力增加内皮细胞中catK 的mRNA和蛋白的表达水平和活性，内皮细胞中的catK有助于剪切应力相关的细胞外基质蛋白水解活性的调节，内皮细胞中catK的表达与人冠状动脉内弹力层的破裂显著相关〔6〕。这些结果提示cat K和L是cat家族中对切应力敏感的成员，通过切应力的调节，cat K和 L 在血管壁的细胞外基质重塑过程中起重要作。

　　5 cat与脂质代谢和炎症的关系

　　氧化型LDL(oxLDL)降低了catL的活性，但诱导了细胞质活性，已经易位到细胞质的溶酶体cat类在细胞凋亡中可能起裂解酶的作用〔14〕。cat K不仅影响粥样斑块的细胞外基质，也影响到泡沫细胞的形成。在小鼠模型中，缺乏cat K会增加肌浆网对OXLDL的摄入，增加巨噬细胞对胆固醇酯的储存。缺乏cat K时，电镜下可见巨噬细胞源的泡沫细胞溶酶体增大。cat K可能通过抑制小凹蛋白和CD36通路而减少巨噬细胞对oxLDL等脂质的摄入。cat在降解(氧化型)LDL中起重要作用，体外研究表明重组catF广泛降解载脂蛋白B100(apoB100)，而catK和S表现为少量的降解。catF降解apoB100导致LDL颗粒的聚集和融合，增加LDL结合蛋白的结合能力，随后导致细胞外脂质积累，这些数据表明catB、F、K和S导致细胞外脂质在血管壁沉积。cat也参与胆固醇的流出，由于前βHDL的蛋白水解作用，catF和S减少胆固醇由巨噬细胞流出的能力。而且catS、F、K降解apoA1导致apoA1刺激胆固醇流出的能力不同程度的丧失〔14〕。这些数据表明减少胆固醇流出的catF、K、S介导胆固醇受体有助于AS中泡沫细胞的形成。cat在脂质摄取、储存、流出机制中的作用已得到部分阐述。然而，cat在脂质代谢中对AS的作用尚未知晓。

　　cat在AS中对炎症的作用的证据较少。在载脂蛋白E/的小鼠中AS模型中catS缺乏能减少巨噬细胞和脂质含量，T细胞数量、IFN含量〔14〕。CatF、S、L可降解MHCⅡ分子的恒定链。然而，未发现cat在抗原递呈与AS的联系的资料。cat除在炎症中起直接作用外，他们也通过减少TGFβ的表达水平起间接作用。 在载脂蛋白E/小鼠中，抑制TGFβ导致斑块表面炎症细胞增加。研究还发现，在载脂蛋白E/小鼠AS模型中，catK能诱导参与TGFβ路径的基因表达增加，这表明catK缺乏曾减少TGFβ的活性，从而减低炎症反应〔6〕。

　　6 cat天然抑制剂在动脉硬化中的作用

　　胱抑素C(Cystatin C) 是半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族2中的成员之一。表达于所有的有核细胞，参与细胞内外蛋白水解的调控，保护细胞免受不适当的内源性或外源性蛋白酶水解。而新近的研究发现，胱抑素C 还可能与AS的发生与发展有关。胱抑素C 是分子量为13 kD的由122 个氨基酸组成的低分子量非糖基化蛋白质，能在所有有核细胞中恒定、持续地转录及表达，包括肾、肝、胰、肠、胃、肺及胎盘等几乎全身的器官组织。胱抑素属典型的分泌型蛋白质，可以在脑脊液、血液、唾液及精液等体液中被发现，且浓度较高，所以是细胞外最主要的内源性半胱氨酸蛋白酶抑制剂之一〔15〕。cat与胱抑素C之间的失衡影响AS斑块。Shi等应用免疫染色法与免疫杂交法发现AS斑块与腹主动脉瘤组织中胱抑素C 含量较正常血管减少，而catS 及K却过度表达。更有意思的是，他们还发现AS斑块中的胱抑素C 水平与疾病进程呈负相关关系。胱抑素C抑制IFN刺激血管平滑肌细胞的促弹性蛋白离解活性。TGFβ1 刺激平滑肌细胞胱抑素C的分泌和随后阻断平滑肌细胞弹性蛋白酶活性〔16〕。当胱抑素C缺乏时，细胞因子或生长因子刺激平滑肌细胞也表现出这些cat的增加。胱抑素 C缺乏时，血管和平滑肌细胞表现出更高的促弹性组织离解活性。脂质含量减少，巨噬细胞含量、T细胞含量不变。这就从侧面更进一步说明了胱抑素C 在动AS与动脉瘤发病中的重要作用。

　　7 展 望

　　cat在AS中起重要作用。抑制cat活性可减少细胞外基质的降解，促进斑块纤维化，可能有助于延缓斑块进展，增加斑块的稳定性。尽管已有许多药品公司致力于cat抑制剂的开发，但他们主要研究的是其在骨质疏松症和骨关节炎中的疗效。cat抑制剂是否能用于AS等心血管疾病的治疗目前尚无相关资料。最近有研究提示cat可作为AS的一项诊断指标。catL在至少一支冠状动脉狭窄10%的As患者中的血清水平显著高于无冠状动脉狭窄者 。与无冠状动脉狭窄者相比，血清cat S的水平在冠状动脉狭窄的As患者中亦显著升高，但血清cat K是否也存在类似变化还需进一步研究。阐明cat K与AS之间的关系，可能为冠心病的防治提供新的研究思路和治疗靶点。

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