关于人结肠癌组织中RUNX3的表达意义

作者：肖开提·阿不都哈德尔 迪力旦·纳赛尔

【摘要】 目的： 探讨人结肠癌及远癌组织中RUNX3 mRNA和RUNX3蛋白表达的临床病理意义. 方法： 用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）分别检测50例手术切除的结肠癌组织及远癌组织中RUNX3 mRNA的表达；用免疫组化方法（SP法）检测100例结肠癌及远癌组织中RUNX3蛋白的表达. 结果： RUNX3 mRNA和RUNX3蛋白在远癌组织中的表达明显高于结肠组织［(0.28±0.05) vs （0.41±0.05），P&<0.01;58% vs 100%，P&<0.01］. RUNX3蛋白的表达与癌细胞分化程度，淋巴结转移以及临床分期（Dukes分期）明显相关(U=144，P&<0.01; χ2=15.11，P&<0.01；χ2=11.02，P&<0.05)与患者性别、年龄及肿瘤部位无关. 结论： RNX3基因的表达异常与结肠癌的发生、发展密切相关.
【关键词】 结肠肿瘤；runt相关转录因子3；转录聚合酶链反应；免疫组织化学
　　 0引言
　　人RUNT相关转录因子3（human runtrelated transcription factor 3， RUNX3）作为RUNT家族成员，参与胚胎发育过程中细胞基因表达调控. 近年来研究发现，RUNX3基因可能在人类多种肿瘤的发病过程中起着重要的作用［1］. 我们通过逆转录聚合酶链反应(RTPCR) 和免疫组织化学方法探讨结肠癌组织中RUNX3 的表达及其与淋巴结转移、临床分期及癌细胞分化程度等的关系.
　　1材料和方法
　　1.1材料20001/200712手术切除病检确诊结肠腺癌50例，手术前均未接受放化疗. 男27例，女23例，年龄30～72(中位46.5)岁. 取癌组织及距癌肿边缘10 cm以上的远癌组织各1 g，再分成两份，1份迅速置于液氮冷冻，-80℃低温冰箱保存；另1份置于40 g/L甲醛液中固定.
　　1.2方法
　　1.2.1RUNX3 mRNA的表达取冻存组织0.1 g液氮中捣碎，转移到EP管中，加入Trizol试剂1 mL，离心匀浆后经氯仿抽提，异丙醇沉淀出总RNA，溶于DEPC水中. 通过紫外分光光度计测A值，计算样品总RNA浓度，并通过琼脂糖电泳检测其纯度. 采用Promega 公司RTPCR(A3500) 两步法试剂盒，按操作说明进行，将RNA 逆转录成cDNA. 参照Zeng 等方法设计引物，目的基因RUNX3 的上游引物为：5′TGGCAGGCAATGACG3′，下游引物为：5′CAGGGAACGGCTTGGT3′，预计扩增片段为258 bp. 内参照βactin上游引物为：5′TTCCAGCCTTCCTTCCTGGG3′，下游引物为：5′TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT3′，目标片段长度224 bp. 反应体系20 μL：去离子水13.8 μL，buffer(10×) 2 μL，dNTP(10 mmol/L) 0.5 μL，cDNA产物1 μL，目的基因及βactin各自上下游引物各0.6 μL，Taq 酶(83.35 mkat/L)0.3 μL. 循环条件为：94℃变性5 min后，进行94℃ 30 s，51℃ 40 s，72℃ 40 s的循环，循环30次后，72℃链延长10 min，冷却至4℃. 于15 g/L琼脂糖电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察PCR条带. PCR扩增产物紫外灯下成相后经光密度扫描仪扫描定量，用gene toolsⅡ软件计算CDX2/βactin条带的A比值表示RUNX3 mRNA的相对表达水平.
　　1.2.2RUNX3蛋白的表达石蜡包埋标本，4 μm连续切片. SP 免疫组化染色试剂盒购自深圳晶美生物技术有限公司，一抗为兔抗人RUNX3 mAb，工作浓度为1∶100；二抗为羊抗兔IgG(均购自深圳晶美公司) . 阴性对照以磷酸盐缓冲液代替一抗. RUNX3蛋白免疫组化染色定位于细胞核，阳性染色呈棕黄色.结果由一名病理科医师采用盲法判断. 按照四级分法，即阳性细胞数≤25%为(+)，26%～50%为()，&>50%为()，无阳性细胞(-)；再结合染色强度， 浅黄色为(+)， 棕黄色()， 棕褐色为()，无着色细胞为(-）；两者合二为一，分成强阳性()，阳性()，弱阳性(+)，阴性(-)进行分析判断.
　　统计学处理： RUNX3 mRNA相对表达量用x±s表示，采用t检验分析组间差异. RUNX3蛋白表达采用非参数检验，采用SPSS12.0统计软件完成，检验水准α＝0.05.
　　2结果
　　2.1RUNX3 mRNA的表达癌组织及远癌组织中RUNX3 mRNA 都有表达，癌水平显著低于癌旁正常组织［(0.28±0.05)vs(0.41±0.05)，P&<0.01，图1，表1］.
　　1:maker； 2:癌组织； 3:癌旁正常组织.
　　图1结肠癌与远癌标本RUNX3 mRNA表达
　　2.2RUNX3蛋白阳性表达结肠癌标本中表达率58%，其中（＋）19例（38%），()10例（20%）；在远癌组织中RUNX3蛋白均为阳性，其中(+)7例，（）29例，（）14例，两组之间存在统计学差异（P&<0.01，图2）. RUNX3蛋白在人结肠癌中的表达与年龄、性别及肿瘤部位无关（P&>0.05），与淋巴结转移、Dukes分期、癌细胞分化程度有关（P&<0.05，表1）. 表1结肠癌组织RUNX3蛋白表达与临床病理的关系 转贴于 3讨论
　　本研究表明在人结肠癌手术切除标本中RUNX3表达下调，并且癌细胞分化程度越低，有淋巴结转移，Dukes分期越晚，RUNX3表达越低，我们推测结肠癌的发生及发展与RUNX3下调有关. 国外研究表明RUNX3蛋白是TGFβ信号通路下游的一个转录因子，可能是TGFβ信号传导通路的靶点［1-2］. 我们认为RUNX3基因的表达下调甚至缺失使TGFβ/Smad信号传导通路紊乱，很可能是结肠癌发生、发展过程中的重要一环.
　　RUNX3基因下调表达的机制目前认为可能与基因缺失和甲基化有关［2-5］. 肿瘤细胞中RUNX3基因启动区CpG岛的甲基化是RUNX3基因失活的主要原因. 在非肿瘤细胞中RUNX3基因CpG岛的甲基化率很低，且与老年有关［6-8］. 结合本研究我们认为推断RUNX3可能作为诊断结肠癌的生物学指标，且对于临床判断结肠癌的恶性程度、临床分期、转移以及术后复发有重要的参考价值.
　　在不表达RUNX3的肿瘤细胞系中加入DNA甲基转移酶抑制剂5氮杂2脱氧胞苷（5aza2deoxycytidine， AZA）和/或组蛋白乙酰基转移酶抑制剂（trichostatin A， TSA）后出现了RUNX3的表达［5，7］，因此，我们认为如果能促进结肠癌细胞中RUNX3表达和转录，就有可能抑制肿瘤细胞生长、转移，降低临床分期，从而为晚期结肠癌患者创造手术条件，提高结肠癌的疗效.

【参考文献】
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