关于siRNA抑制ADAR1的表达对混合培养的小鼠淋巴细胞周期和凋亡的影响

作者：霍斌亮 蔡磊 马俊 张福琴 赵青川

【摘要】 目的：探讨RNA编辑酶ADAR1的表达受抑制后，小鼠淋巴细胞的细胞周期和细胞凋亡的变化. 方法： 用电转法将ADAR1特异性siRNA转入到处于混合培养的小鼠淋巴细胞中，培养48 h，RTPCR检测转染效率；流式细胞仪检测细胞周期和凋亡变化；RTPCR检验周期蛋白D1（cyclin D1）基因和周期蛋白A1（cyclin A1）基因表达量的变化. 结果： 转染ADAR1特异性siRNA 48 h后，小鼠淋巴细胞G0/G1期细胞量增加，S期细胞量减少，G2/M细胞量保持恒定. 另外，cyclin D1基因的表达量降低而cyclin A1基因表达保持恒定. 结论： 处于经典混合培养体系下的小鼠淋巴细胞，在其RNA编辑酶ADAR1受到特异siRNA抑制后，小鼠淋巴细胞的周期受到明显抑制，细胞凋亡增加.
【关键词】 小干扰RNA；ADAR1；淋巴细胞；细胞周期；细胞凋亡；小鼠
　　0引言
　　ADAR1（RNAdependent adenosine deaminase 1）是近来研究最为重要的一种RNA编辑酶，目前发现它与众多疾病的发生进展有关［1-3］. ADAR1是通过脱氨基的方式使RNA特异位点腺嘌呤核苷变为次黄嘌呤核苷，从而改变RNA的遗传密码，进而使其编码的蛋白质结构和功能也发生改变. RNA干扰（RNA interference， RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（doublestranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象. Small interfering RNA(siRNA)是一种小RNA分子（21~25核苷酸），能介导识别并靶向切割同源性mRNA，高效抑制靶mRNA的表达. 我们应用RNAi技术借助混合淋巴细胞培养试验模型研究ADAR1特异的siRNA对小鼠淋巴细胞周期和凋亡的影响， 进一步揭示ADAR1在移植排斥中的作用.
　　1材料和方法
　　1.1材料BALB/c 和 C57小鼠，雄性，18～25 g，各5只(第四军医大学实验动物中心)，淋巴细胞分离液(上海华精生物高科技有限公司)，DMEM培养基(美国GIBCO公司)，标准胎牛血清(天津市颢阳生物制品科技责任有限公司)， ADAR1特异的siRNA片段及阴性对照siRNA（广州锐博生物科技有限公司），反转录试剂盒（Fermentas公司），2×Taq PCR MasterMix（北京天为时代科技有限公司），4308电转电融合仪（Eppendorf公司），Mastercylerep型PCR扩增仪(Eppendorf公司)，EPS 2A200型电泳仪(Amersham Biosciences公司)，FR200凝胶成像系统（上海复日科技有限公司），1100 pro型分光光度仪(Ultrospec公司)，318K型离心机(Sigma公司)，流式细胞仪（BD公司）.
　　1.2方法
　　1.2.1引物及引物设计ADAR1及GAPDH引物由上海鼎安生物科技有限公司合成，ADAR1基因上游引物5′CCTGTCAGCGGGTTGTTAGAGTA3′，下游引物5′TGGGAGCCATAGATTCATCAAGT3′，产物长度是610 bp；GAPDH上游引物5′CATCACTGCCACCCAGAAGA3′，下游引物5′TGAAGTCGCAGGAGACAACC3′，产物长度为320 bp；siRNA的正义链(5′3′)：CCAGUACUGUGUAGCAGUA dTdT，反义链(3′5′)：dTdT GGUCAUGACACAUCGUCAU；阴性siRNA产品名称NControl_05815，产品编号2005815122147. Cyclin D1，cyclin A1 的基因序列来源与GenBank，引物由Primer Premier 5软件设计，cyclin D1基因的上游引物5′CAGCCCTGTTACCTGATACCT3′，下游引物5′TCCCAAGCACCTCATACTACC3′，产物长度是517 bp；cyclin A1基因的上游引物5′GTAACGGAGTATGCAGAGGAG3′，下游引物5′AAATGCCAGGACTTTGAGTAG3′，产物长度是390 bp.
　　1.2.2小鼠淋巴细胞分离将BALB/c小鼠和C57小鼠分别脱颈处死，750 mL/L乙醇浸泡5 min，无菌取脾，Dhanks液冲洗1次，含青霉素、链霉素的双抗溶液冲洗1次，放入6 cm培养皿中，加入3 mL Dhanks液，眼科剪将脾脏剪碎，玻璃空针针芯将碎片压碎，用400目塞网过滤，将滤得的液体以1∶1的比例小心加于小鼠淋巴细胞分离液的液平面上，2500 r/min离心25 min，取中间云雾状细胞层，加入适量Dhanks洗涤，1000 r/min离心10 min，得白色细胞沉淀，以同样的方法将所得沉淀洗涤两遍，然后将细胞重悬于含100 mL/L胎牛血清的DMEM，计数. 将BALB/c小鼠细胞密度调整为1.5×109/L， C57小鼠细胞密度调整为2×109/L，按1∶1比例混合两种小鼠的淋巴细胞后，调整细胞密度为1.75×109/L.
　　1.2.3电穿孔法瞬时转染小鼠淋巴细胞1000 r/min离心10 min，收集上述各组细胞，分别加入电转仪配备的低渗穿孔液800 μL重悬，转到800 μL穿孔杯中，置于4℃环境下预冷10 min. 将分离得到的淋巴细胞分为4组：转染组加入20 μL特异的siRNA吹匀，给予800 V和40 ms电穿；阴性对照组加入20 μL阴性对照siRNA吹匀，给予800 V和40 ms电穿；对照组直接给予800 V和40 ms电穿；空白组不做处理. 电穿后立刻将各组置于4℃环境下2 min，再置于37℃水浴锅8 min，之后转移到150 mL培养瓶中加入含100 mL/L胎牛血清的DMEM进行培养.
　　1.2.4流式细胞仪检测细胞周期1000 r/min，离心5 min，分别收集转染48 h的上述4组细胞，弃上清，用1 mL PBS重悬细胞，再离心洗涤细胞1次，吸弃上清；加入预冷的700 mL/L乙醇1 mL固定，4℃固定过夜. 次日1000 r/min离心5 min，弃上清，加入10 g/L碘化丙锭(PI)染液和10 g/L RNA酶(RNase)溶液1 mL，4℃避光保存30 min，3 mL的PBS洗细胞1次，离心后用300 μL的PBS重悬，用流式细胞仪进行检测.
　　1.2.5流式细胞仪检测细胞凋亡分别收集上述转染48 h的4组细胞(1×105)至试管中，加入荧光标记的Annexin VFITC试剂和PI，混匀后避光室温下孵育15 min，之后加入400 μL染色缓冲液，立即上流式细胞仪进行分析.
　　1.2.6RTPCR检测ADAR1，cyclin D1，cyclin A1的表达量用Trizol提取转染48 h的4组细胞的总RNA，各取总RNA 2 μL，oligo(dT) 1 μL，DEPC处理水9 μL，加入反应管，轻轻混合均匀，在微量离心机离心3～5 s；70℃孵育5 min，拿出后立即冰浴，微量离心机离心；依次加入5×反应缓冲液4 μL，RNA酶抑制剂1 μL，dNTP（10 mmol/L）2 μL，混合均匀，微量离心机离心，37℃孵育5 min加入MMuLV 1 μL，42℃孵育60 min ；70℃ 10 min停止反应，即可得到所需的cDNA. 取cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，2×Master Mix 12.5 μL，加到PCR反应管中，ddh3O补至25 μL，PCR仪中扩增. 反应条件为94℃预变性3 min；94℃变性30 s；55℃退火30 s；72℃延伸1 min，30个循环. 各取产物5 μL，GAPDH作为内参，加样至10 g/L琼脂糖凝胶上电泳30 min，凝胶成像系统中观察.
　　统计学处理:数据以x±s表示，多组间计量资料采用方差分析法，两两间比较用LSDt检验，P&<0.05为差异有统计学意义，数据分析均采用统计学软件SPSS11.0完成.
　　2结果
　　2.1转染siRNA对ADAR1表达量的影响转染siRNA 48 h后，转染组条带的亮度明显低于其他3组，ADAR1的表达量明显不足；对照组和阴性对照组的差异不大，但比未转染组略有下降，条带亮度略低于未转染组（图1）.
　　2.2流式细胞仪检测细胞周期与凋亡转染siRNA 48 h后，转染组的G0/G1期的细胞明显高于其他3组（P&<0.05），S期细胞低于其他3组（P&<0.05），除空白对照外，其他3组处于G2/M期的细胞没有明显的差异（P&<0.05，表1）. 另外，转染组的凋亡细胞量高于其他3组（P&<0.05，表2）. 表1不同处理组小鼠淋巴细胞的细胞周期分布表2不同处理组小鼠淋巴细胞的细胞凋亡情况
　　2.3cyclin D1与cyclin A1的表达量变化转染siRNA 48 h后，转染组cyclinD1的表达明显低于其他3组，而cyclinA1表达未发现明显的变化（图2）. 　　1：空白对照组； 2：对照组； 3：阴性对照组； 4：转染组.
　　图2不同处理组cyclinD1和cyclinA1表达量的变化
　　3讨论
　　2001年，Rabinovici等［4］发现，重症感染的小鼠肝、脾、胰、淋巴结和胸腺中ADAR1的表达和活性显著增高，说明ADAR1在炎症和免疫系统中发挥着重要的作用. 2002年，Zhao等［5-6］研究表明，小鼠原代淋巴细胞增殖过程中，存在ADAR1的活性升高的现象. 2003年Yang等［7-8］又发现内毒素，TNFα等炎性介质能诱导T淋巴细胞和巨噬细胞高表达ADAR1. 近来有研究发现［9-10］：①大鼠肝移植术后，发生肝移植排斥反应时，脾和肝细胞的ADAR1的表达量增高3～5倍；应用FK506控制后，ADAR1的增幅明显降低.②将绵羊红细胞注入BALB/c和C57小鼠的腹腔后，发现胸腺、脾以及淋巴结内ADAR1的活性显著升高；而同品系小鼠之间输注全血成分，ADAR1的变化不明显.③在淋巴细胞杀伤实验中，当siRNA质粒干扰ADAR1的表达后，淋巴细胞对靶细胞的杀伤作用明显降低 . 这些都提示ADAR1在炎症以及免疫排斥反应中可能有其重要的意义.
　　我们前期观察siRNA干扰对混合培养的小鼠淋巴细胞的影响［11］，发现小鼠ADAR1受到抑制后，小鼠淋巴细胞的增殖速度明显变缓，但这种抑制发生在小鼠淋巴细胞周期的哪个阶段，机制尚不清楚. 通过本研究，我们发现：ADAR1表达受抑制后，转染组G0/G1期细胞含量高于其他3组（P&<0.05）；S期细胞含量低于其他3组（P&<0.05）；G2/M期细胞含量与阴性对照组和对照组无明显差异（P&<0.05），但由于电穿孔的影响略低于空白对照组. 推测ADAR1可能主要是通过调节G0/G1期到S期细胞的变化来影响细胞周期的变化的. 此外通过检测cyclin D1和cyclin A1的mRNA表达量，我们发现，主要影响G0/G1期到S期变化的cyclin D1基因在转染组中的表达量要少于其他3组，而代表G2/M期的cyclin A1表达量无明显的变化，这更进一步证明了ADAR1影响细胞周期的作用可能发生在G0/G1期到S期这一过程中. 另外，我们发现ADAR1受抑制后，转染组的凋亡率明显高于其他3组（P&<0.05）. 这表明ADAR1在正常细胞凋亡过程中起重要作用.
　　综上所述，我们认为ADAR1在调节细胞免疫排斥反应中起重要作用，并且可能主要是通过调节G0/G1期到S期转变来影响细胞周期的，而对于cyclin D1和cyclin A1基因的研究只是起一种指向性作用.

参考文献

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