关于心肌营养素1对谷氨酸诱导神经元凋亡的抑制作用及机制

作者：束晓梅 李振宏 陈雪梅 杜淑珍

【摘要】 目的： 探索重组腺病毒心肌营养素1(AdvCT1) 对谷氨酸(Glu)诱导神经元凋亡的保护作用及相关机制，为脑损伤提供新的治疗措施. 方法： 海马神经元分为3组：单纯Glu组、CT1干预组（AdvCT1转染）及对照组；利用相差显微镜检查、DNA片段检测、乳酸脱氢酶（LDH）活性及流式细胞技术，对各组神经元进行凋亡检测；Western Blot检测Caspase3活性变化及线粒体内和胞浆内细胞色素C(Cyt C) 水平变化. 结果： Glu组神经元呈现明显形态改变，并见DNA梯状条带形成，CT1组未见类似改变；Glu组神经元在Glu暴露后6， 9及18 h，LDH释放量（14.3%，24.6%及28.4%）及凋亡率（6.2%，18.8%及26.4%）均高于CT1组（分别为9.2%，16.1%，19.7%及3.6%，11.3%，16.1%）；Glu组Caspase3活性3 h即增加（25.6%），6 及9 h达到62.4%及46.1%，CT1组3 h时的Caspase3表达分别为13.6%，45.2%及17.1%，均低于Glu组(P&<0.05)；Glu暴露30 min，神经元胞质内Cyt C水平增加，之后进行性增高，线粒体内Cyt C进行性减少；Glu暴露后6 h，CT1组神经元胞质内Cyt C较Glu组减少了55.7%（P&<0.05）. 结论： Glu诱导海马神经元凋亡的机制涉及线粒体Cyt C释放，激活Caspase级联反应；CT1对损伤神经元的保护作用可能是经由线粒体信号转导途径、通过减少线粒体Cyt C释放而实现的.
【关键词】 心肌营养素1；神经保护；凋亡；谷氨酸；线粒体；细胞色素C
0引言
　　新近发现心肌营养素1(cardiotrophin1， CT1) 可能是对中枢神经系统有重要保护作用的细胞因子［1］. 现少见CT1是否可保护谷氨酸(glutamate， Glu)诱导神经元损伤的报道. 我们利用携带CT1基因的重组腺病毒(recombinant adenovirus CT1， AdvCT1)体外转染神经元细胞，观察CT1对谷氨酸诱导神经元凋亡的保护作用及可能的机制，为神经系统损伤疾患的治疗提供理论基础.
　　1材料和方法
　　1.1材料重组腺病毒液（第三军医大学野战外科研究所馈赠）；小鼠抗大鼠CT1 mAb(Sigma 公司)；生物素标记羊抗大鼠IgG（武汉，Boster公司）；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase， LDH）检测试剂盒（Sigma公司）；AnnexinVFluos 试剂盒(瑞士Roche 公司)；Caspase3多克隆抗体（Sigma公司）；Bradford试剂盒（碧云天生物技术研究所）；线粒体细胞色素C检测试剂盒（晶美生物工程公司）.
　　1.2方法
　　1.2.1AdvCT1转染神经元及鉴定新生Wistar大鼠(0～1 d)，取出海马，剪碎，胰酶消化， 1×109/L细胞悬液接种. 神经元培养第8日，加入3.98×1011 pfu/L重组腺病毒液0.1 mL，继续培养48 h. 免疫组化鉴定CT1：一抗为小鼠抗大鼠CT1 mAb，二抗为生物素标记羊抗大鼠IgG，阳性细胞棕黄色着色，染色位于胞质内.
　　1.2.2Glu诱导神经元凋亡模型神经元培养第10日，暴露于50 μmol/L的Glu培养液30 min，吸去含Glu培养液， 添加新鲜培养液， 按实验所需继续培养至相应时间点. 神经元分为单纯Glu组、CT1组（AdvCT1转染神经元）及对照组.
　　1.2.3神经元LDH活性检测按说明书操作，于培养至第8日进行，分别于Glu暴露30 min 后3，6，9，18 h进行，每组4个标本. 为便于比较，其活性用LDH最大释放量的百分数表示.
　　1.2.4神经元DNA片段电泳条带分析神经元暴露Glu后继续培养8 h，提取DNA，琼脂糖凝胶电泳， 溴化乙锭染色，紫外光下观察记录结果并照相保存.
　　1.2.5流式细胞仪检测神经元凋亡按试剂盒说明操作. Glu暴露3， 6，9，18 h，调整浓度5×108/L，加入5 μL FITCAnnexin V及5 μL PI，温育，洗涤，上机分析，采用CELLQUEST软件分析数据.
　　1.2.6Western Blot检测神经元Caspase3水平收集细胞，洗涤，裂解，离心，Bradford试剂盒测定蛋白浓度，20 μg上样，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，与Caspase3多克隆抗体孵育，辣根过氧化酶标记的二抗孵育，增强化学发光法检测蛋白质条带Caspase3水平，以Actin水平作为等量蛋白质上样对照. 图像分析软件（Image Pro. Plus 4.5）分析结果，印迹条带吸光度 = 平均吸光度×面积，Caspase3水平用对照组的百分数表示.
　　1.2.7神经元细胞色素C水平检测于Glu作用30 min，1，3，6 h，分离神经元线粒体部分及胞质部分［2］，Western Blot法测细胞色素C(cytochrome c， Cyt C)水平，一抗为小鼠抗Cyt C mAb，二抗用辣根过氧化酶标记. 图像分析软件分析结果，Cyt C水平用对照组的百分数表示. 另外，分别检测Glu暴露后6 h各组神经元胞质内Cyt C水平.
　　统计学处理：每组4个标本，每个标本重复检测3次，测量结果表示为x±s，组间数据用Office 2000Excel统计程序进行t检验，P&<0.05为有统计学差异.
　　2结果
　　2.1AdvCT1转染神经元及鉴定AdvCT1转染48 h，免疫组化显示CT1染色阳性细胞占90%以上，阳性染色主要位于胞质（图1）.
　　图1心肌营养素1免疫组化检测ABC ×200
　　2.2神经元形态学改变相差显微镜观察发现Glu组神经元死亡，细胞数量减少，形态变园、皱缩，突起减少，见细胞碎片；CT1组神经元病变程度较轻；对照组基本保持正常形态（图2）.
　　A: 谷氨酸； B: 心肌营养素1； C: 对照.
　　图2谷氨酸诱导海马神经元形态改变×200
　　2.3神经元DNA条带形成Glu组可见明显DNA梯状条带形成，对照组及CT1组电泳条带依然在点样孔附近，未见明显梯状带（图3）.
　　1：DNA Marker； 2：对照； 3： 谷氨酸； 4：心肌营养素1.
　　图3DNA琼脂糖凝胶电泳（溴化乙锭染色)
　　2.4神经元LDH活性变化Glu组神经元Glu暴露后6，9及18 h，LDH释放量［（14.3±2.6）%，（24.6±4.1）%，（28.4±3.6）%］均高于CT1组［（9.2±2.1）%，（16.1±3.8）%，（19.7±5.0）%］，差异有统计学意义（P&<0.05）.
　　2.5神经元凋亡率改变Glu组神经元Glu暴露后6，9及18 h细胞凋亡率［（6.2±1.5）%，（18.8±3.8）%，（26.4±3.40）%］均高于CT1组［（3.6±1.0）%，（11.3±2.5）%，（16.1±4.6）%］，差异有统计学意义（P&<0.05）.
　　2.6神经元Caspase3活性改变Glu作用后不同时间点Caspase3活性显示，单纯Glu组Caspase3活性3 h即增加(25.6±3.2)%，6，9 h达到（62.4±6.2）%及（46.1±4.2）%，CT1组3个时点的Caspase3分别为（13.6±4.5）%，（45.2±5.6）%及（17.1±3.8）%，均低于Glu组(P&<0.05). 　　2.7神经元Cyt C水平变化Glu暴露前Cyt C主要存在于线粒体内，胞质中含量极少；暴露后线粒体中Cyt C快速释放入胞质，30 min胞质内Cyt C水平增加，之后迅速上升，而线粒体内Cyt C水平进行性减少，3 h胞质内Cyt C水平已超过线粒体内，6 h已超过4倍多（图4）. Glu暴露后6 h，CT1组神经元胞质内Cyt C较Glu组减少了55.7%.
　　aP&<0.05 vs 对照.
　　图4谷氨酸诱导神经元线粒体中Cyt C的释放
　　3讨论
　　CT1是一种促进心肌细胞生长的细胞因子，可保护氧化应激诱导的神经元损伤，可能对脑损伤有保护作用［3］. Toth等［4］报道CT1基因腺病毒转染对PC12细胞的保护作用明显大于直接使用细胞因子. 我们前期实验证明50 μmol/L谷氨酸为较理想的神经元凋亡模型. 我们利用此模型，以AdvCT1转染神经元，从不同角度证实了CT1可抑制Glu诱导的神经元凋亡.
　　为探索Glu诱导神经元凋亡的可能机制，以及CT1对它的影响，我们观察Glu暴露后不同时间Caspase3活性改变，发现Glu组Caspase3活性早期（3 h，凋亡未发生）即增加，6 h达高峰. 从时间上看，神经元凋亡发生在Caspase3活性增加后，可能通过激活Caspase3而实现. Caspase3是细胞凋亡的主要执行者，可酶切DNA酶抑制剂，导致DNA的片段化，被称为细胞凋亡的“终结者”. 本实验显示CT1可抑制Caspase3激活，CT1组神经元在3，6及9 h Caspase3活性均低于Glu组.
　　参与Caspase3激活的上游信号繁多而复杂. 正常情况下Cyt C位于线粒体内外膜之间，凋亡刺激物可引起Cyt C从线粒体易位释放入胞质，与凋亡蛋白水解酶活化因子(Apaf1)结合形成Cyt C/Apaf1复合物，启动Caspase 级联反应，导致凋亡发生［5］. 我们发现Glu可诱导神经元线粒体内Cyt C早期快速释放入胞质，线粒体内Cyt C水平进行性减少. 从发生时间看，线粒体中Cyt C释放发生在Caspase3活性增加之前. 我们推测Glu诱导神经元凋亡的机制，可能通过促进Cyt C释放，使Caspase3得以活化，进而激活了DNA片段化因子，最终使神经元细胞进入凋亡状态. 而CT1组神经元在Glu暴露后6 h，胞质内Cyt C水平低于单纯Glu组，说明CT1可抑制线粒体Cyt C释放. 然而，CT1是通过何种方式减少Cyt C从线粒体释放的尚不清楚。据报道CT1在神经系统中的信号通路与酪氨酸激酶（JAK）、信号与转录活化因子（STAT）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷酸化肌醇脂3激酶（PI3K）有密切联系，可能通过相关激酶的激活或促进转录因子磷酸化，发挥对损伤神经元的保护作用［3］. 我们推测CT1通过激活相关激酶或转录因子的磷酸化，在线粒体水平参与Cyt C释放的调控，通过抑制Cyt C释放，发挥对损伤神经元的保护作用.
　　致谢本研究得到第三军医大学野战外科研究所廖维宏教授及杨云华博士馈赠的AdvCT1重组腺病毒，表示衷心感谢！
【

参考文献

】
［1］ Wen TC， Rogido MR， Moore JE， et al. Cardiotrophin1 protects cortical neuronal cells against free radicalinduced injuries in vitro［J］. Neurosci Lett， 2005， 387(1): 38-42.

［2］ Zhang YM， Bhavnani BR. Glutamateinduced apoptosis in primary cortical neurons is inhibited by equine estrogens via downregulation of caspase3 and prevention of mitochondrial cytochrome c release［J］. BMC Neurosci， 2005， 6(1):13-36.

［3］ 杨云华， 廖维宏. 心肌营养素1在神经系统中的信号通路［J］. 中国临床神经科学， 2007， 15(1): 96-100.

［4］ Toth G， Yang H， Anguelov RA， et al. Gene Transfer of glial cellderived neurotrophic factor and cardiotrophin1 protects pc12 cells from injury: Involvment of the phosphatidylinositol 3kinase and mitogenactivated protein kinase kinase pathway［J］. J Neurosci Res， 2002， 69(5): 622-632.

［5］ Riedl SJ， Salvesen GS. The apoptosome: Signalling platform of cell death［J］. Nat Rev Mol Cell Biol， 2007， 8(5):405-413.