关于人骨髓间充质干细胞对异体外周血T淋巴细胞的抑制作用及机制

　　　　　　　　 作者：白海 司志刚 王存邦 薛智文 吴涛 杨小亮

【摘要】 目的： 探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）体外对异体外周血T淋巴细胞的抑制作用及机制. 方法： 从骨髓中分离培养MSCs，反复贴壁进行纯化；用尼龙棉柱法纯化异体外周血T淋巴细胞；观察MSCs对植物血凝素（PHA）刺激下T淋巴细胞增殖的影响，用ELISA方法检测IFNγ，IL4水平变化. 结果： MSCs对PHA诱导的T淋巴细胞增殖有抑制作用，并呈剂量依赖性；同时MSCs亦可抑制T淋巴细胞的IFNγ分泌，但可促进IL4的分泌. 结论： MSCs对异体外周血T淋巴细胞的增殖有抑制作用，其作用可能与其影响T淋巴细胞分泌IFNγ和IL4有关.
【关键词】 骨髓间充质干细胞；T淋巴细胞；免疫调节；干扰素γ；白细胞介素4
　　 0引言
　　骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是骨髓中不同于造血干细胞的另一类成体干细胞，这类细胞易于采集、分离和体外扩增，除具有高度增殖及多向分化潜能、促进机体造血重建外，还具有抑制同种异体免疫反应、减轻移植排斥等免疫调节作用，但具体机制还不清楚. 为进一步探讨MSCs的免疫调节功能，我们研究了MSCs对T淋巴细胞增殖及其分泌IFNγ与IL4的影响.
　　1材料和方法
　　1.1骨髓MSCs的分离、培养与鉴定抽取肝素抗凝的健康供者骨髓20 mL（n=10），DMEM（Gibco）倍比稀释，Ficoll分离液（天津灏洋）2000 r/min，15 min条件下分离出单个核细胞，DMEM洗涤2次，完全培养基（100 g/L胎牛血清+ DMEM）重悬细胞，以2×109/L接种于25 cm2培养瓶内，37℃，50 mL/L CO2孵箱内培养，24 h首次换液，以后每2～3 d换液1次，细胞融合度达80%时消化传代培养，流式细胞仪分析检测传至3代MSCs的纯度.
　　1.2外周血T淋巴细胞的分离与纯度鉴定取新鲜肝素抗凝人外周血20 mL，Ficoll分离液（2000 r/min，15 min）分离出单个核细胞，尼龙棉柱法进一步分选T淋巴细胞，流式细胞仪分析尼龙棉柱分离前后T淋巴细胞的纯度.
　　1.3MSCs对植物血凝素（phytohemagglutinin， PHA）作用下的T淋巴细胞增殖的影响取第3代培养的MSCs，经60Co照射30 Gy，调整细胞密度，按细胞数分为3组，A组1×103个，B组1×104个，C组1×105个，每组设单独同等数量MSCs为空白对照，以单独T淋巴细胞培养为阳性对照. 以终体积100 μL／孔，加入96孔培养板内，MSCs完全贴壁后吸去上清或更换培养液，并除空白对照外各组加入T淋巴细胞1×104/孔. 经PHA 5 μg（Sigma）作用68 h后加入20 μL／孔MTT（Sigma）继续孵育4 h，弃上清后二甲基亚砜固定，酶标仪490 nm处测定A值，增殖百分率=（实验组A值-对照组A值）/实验组A值.
　　1.4MSCs对PHA刺激下的T淋巴细胞IFNγ，IL4分泌的影响分别用1×107/L，1×108/L MSCs与1×109/L的T淋巴细胞共培养，同时加入5 μg 的PHA. 应用IFNγ，IL4试剂盒（武汉博士德）检测各组培养上清中IFNγ和IL4浓度.
　　统计学处理：应用SPSS软件进行统计分析，实验结果用x±s表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用Dunnettt检验，P&<0.05为有统计学差异.
　　2结果
　　2.1MSCs与T淋巴细胞纯度鉴定原代MSCs形态均匀一致，呈长梭形，流式细胞仪结果显示：传至3代MSCs高表达CD29，CD44和CD13，而CD34，CD45，HLADR低或极低表达，纯度达90%以上；异体外周血单个核细胞经尼龙棉柱分离后CD3+细胞百分比达98%以上.
　　2.2MSCs抑制T淋巴细胞的增殖MSCs对PHA刺激下的T淋巴细胞增殖呈抑制效应，并呈剂量依赖性. 单纯RPMI1640培养基条件下，T淋巴细胞阳性对照组的增殖率为（77.05±1.94）%，A，B，C组依次为（44.94±5.84）%，（33.45±7.00）%，（17.64±4.59）%，与阳性对照组比较均有统计学差异（P&<0.05）.
　　2.3MSCs抑制T淋巴细胞IFNγ的分泌在单纯培养条件下，T淋巴细胞在PHA刺激下其上清分泌IFNγ为（79.16±13.40）ng/L，与1×107/L，1×108/L的MSCs共培养时IFNγ的分泌分别为（25.54±7.05），（9.55±3.60）ng/L，IFNγ分泌明显减少（P&<0.05）.
　　2.4MSCs促进T淋巴细胞IL4的分泌在单纯培养条件下，T淋巴细胞在PHA刺激下其上清分泌IL4的量为（46.04±9.67）ng/L，加入1×107/L，1×108/L MSCs后，IL4的分泌增加，分别为（67.10±11.44），（97.92±19.48）ng/L，与单纯T淋巴细胞培养组比较差异具有统计学意义（P&<0.05）.
　　3讨论
　　MSCs是骨髓中的一类成体干细胞，是造血微环境的主要细胞成分，能分泌多种细胞因子，在维持造血微环境的稳定中起重要作用［1］. 在特定条件下具有向脂肪细胞、成纤维细胞、成骨细胞等多系分化的能力［2］. 目前研究发现，骨髓MSCs还具有免疫负调节和降低移植物抗宿主疾病(graftversushost disease， GVHD)的作用［3-4］. 小鼠的移植实验及临床的I，II期研究均发现，骨髓MSCs与造血干细胞共输注可以降低异基因造血干细胞植入引起的GVHD. Bartholomew等［5］将体外扩增的供者MSCs输注给行皮肤移植的狒狒体内，结果是皮肤移植物被排斥时间明显延长，提示MSCs具有免疫负调节能力. 并且骨髓MSCs低表达或不表达MHC II(HLADR)， B7， CD40和CD40L，说明MSCs可能不具免疫原性，自身不引起T细胞的识别而产生免疫排斥［3］，为进一步临床应用提供了可能.

转贴于 我们的实验结果亦表明MSCs能抑制PHA诱导的异体T淋巴细胞的增殖反应，并且其抑制作用与MSCs的细胞数量有关，呈细胞数量依赖性，与报道一致［3］. MSCs对T淋巴细胞增殖抑制作用的机制尚不清楚. 有学者指出，MSCs发挥免疫抑制效应无需抗原递呈细胞或CD4+CD25+调节性T细胞参与［6］，提示细胞间的直接接触是MSCs发挥抑制效应的重要环节；MSCs在体外培养条件下能分泌多种可溶性细胞因子，如TGFβ，HGF，可能是介导MSCs免疫调节作用的重要因子［7］，为了解MSCs对T淋巴细胞分泌细胞因子的影响，我们检测了MSCs作用下T细胞培养上清中IFNγ和IL4的变化，结果表明MSCs可抑制T淋巴细胞IFNγ的分泌，而促进IL4的分泌，并且在本检测条件下，MSCs对这二类细胞因子的影响具有一定的MSCs细胞浓度依赖性. 已知IFNγ是Thl细胞免疫正调节因子，而IL4主要由Th3细胞分泌的细胞因子. 结果说明MSCs可能以抑制Thl， 增强Th3的功能为主. 在异基因造血干细胞移植后GVHD发生的病理生理过程中，除了直接由T细胞介导的细胞毒作用外，大量的炎性细胞因子如白细胞介素(IL)，肿瘤坏死因子(TNF)，干扰素(IFN)等参与了GVHD的发生发展. 特别是在急性GVHD中，IFNγ是关键调节因子，在促使单核巨噬细胞产生大量IL1和TNFα中起重要作用［8］，因此，T细胞分泌IFNγ的减低，可以消减GVHD发生发展中免疫应答和“细胞因子风暴”的恶性循环，降低GVHD发生. 有证据表明，IL12，IL4对Thl和Th3细胞的分化启动和进一步发展起着主要作用［9］. Th3细胞分化的最主要决定因素是IL4. 此外，IL4对Th3细胞的增殖、基因转录以及抗凋亡也起着十分重要的作用，从而可减低GVHD和移植物排斥的发生. 所以MSCs体外抑制T细胞增殖并减少T细胞IFNγ的分泌， 增加IL4的分泌，可能是MSCs体内预防和减轻GVHD的机制.

参考文献

［1］ 江逊，崔鹏程，陈文弦，等．人骨髓间充质干细胞体外培养及生物特性的观察［J］．第四军医大学学报，2003， 24(4):351-353.

［2］ Horwitz EM. MSC: A coming of age in regenerative medicine［J］. Cytotherapy， 2006， 8(3): 194-195.

［3］ Klyushnenkova E， Mosca JD， Zernetkina V. T cell responses to allogeneic human mesenchymal stem cells: Immunogenicity， tolerance， and suppression［J］. J Biomed Sci， 2005， 12(1): 47-57.

［4］ 吴涛，白海，王存邦，等．成人骨髓间充质干细胞抑制异体淋巴细胞增殖的实验研究［J］．中华微生物学和免疫学杂志，2006， 27(2):111-113.

［5］ Bartholomew A， Sturgeon C， Siatskas M， et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo［J］. Exp Hematol， 2002， 30(1): 42-48.

［6］ Krampers M， Glennie S， Dyson J， et al. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of native and memory antigenspecific T cells to their congnate peptide［J］. Blood， 2003， 101(9): 3722-3729.

［7］ Tse WT，Pendleton JD，Beyer WM，et al．Suppression of allogeneic Tcell proliferation by human marrow stromal cells：Implications in transplantation［J］. Transplantation， 2003， 75(3): 389-397.

［8］ Reddy P. Pathophysiology of acute graftversushost disease［J］. Hematol Oncol， 2003， 21(4):149-161.

［9］ Kamogawa Y， Minasi LA， Carding SR. The relationship of IL4 and IFN gammaproducing T cells studied by lineage ablation of IL4producing cells［J］. Cell， 1993， 75(5):985-995.