关于反相高效液相色谱法测定补骨脂酊中补骨脂素和异补骨脂素的含量

代写论文网： 【摘要】 目的 建立反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定补骨脂酊中补骨脂素(psoralen)和异补骨脂素(isopsoralen)的含量。方法 以Waters XTerra RP18(4.6 mm×250 mm，5 μm)为色谱柱，以乙腈－水（0.28∶0.52）为流动相，检测波长247 nm。结果 补骨脂素和异补骨脂素保留时间分别为14.326 min 和15.259 min；补骨脂素的线性范围为0.88～14.08 mg·L-1(r=0.9998)；异补骨脂素的线性范围为0.80～12.80 mg·L-1（r=0.9999）。补骨脂素的平均加样回收率为99.5％，RSD为1.10％；异补骨脂素的平均加样回收率为100.4％，RSD为0.59％。结论 本方法简便、快速、准确，可用于补骨脂酊制剂的质量控制。
【关键词】 补骨脂酊 补骨脂素 补骨脂素 反相高效液相色谱法
　　Abstract:Objective An RP-HPLC method was established for determination of psoralen and isopsoralen in Buguzhi tincture.Methods The XTerra RP18 (4.6 mm×250 mm，5 μm) was used. The mobile phase consisted of acetonitrile-water (0.28∶0.52). The detection wave length was 247 nm.Results The retention time of psoralen and isopsoralen angelicin was 14.326 min and 15.259 min respectively. The calibration range of psoralen was 0.88～14.08 mg·L-1. (r=0.9998) and that of isopsoralen was 0.80～12.80 mg·L-1（r=0.9999）; the average recovery was 99.5％（RSD=1.10％） and 100.4％（RSD=0.59％） respectively.Conclusion The method， being simple， rapid and accurate， can be used to examine the quality of Buguzhi tincture.
　　Key words: Buguzhi tincture； psoralen； isopsoralen； RP-HPLC
　　补骨脂酊是中药补骨脂通过提取制成的酊剂，其含有补骨脂素(psoralen)、异补骨脂素(isopsoralen)等有效成分，有镇静、解痉、抗癌和光敏等作用［1］。其有效成分能在黑色素细胞中浓集，在紫外线的作用下，能增加酪氨酸酶的活性，从而增加色素的生物合成能力，用于治疗白癜风［2］。补骨脂的有效成分测定方法有双波长薄层扫描法［3］、高效液相色谱法［4-5］等。补骨脂酊是我院使用多年的中药制剂，仅有定性鉴别，而无定量测定方法。本实验建立反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定其有效成分，方法简便，结果较满意，可作为补骨脂酊的质量控制。
　　1 仪器和试药
　　1.1 仪器 美国Waters高效液相色谱仪（包括1525二元高压梯度泵、717自动进样器、2487双波长检测器）；BP 618型电子分析天平（德国）；KS-80D型超声清洗机（宁波海曙科生超声设备有限公司）；XW-80A旋涡混合器（上海医科大学仪器厂）；pHS-3C型精密pH计（上海雷磁仪器厂）。
　　1.2 试药 补骨脂素中药化学对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110739－200511）；异补骨脂素中药化学对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110738－200309）；补骨脂酊为本院制备，甲醇、乙腈为色谱纯。
　　2 方法和结果
　　2.1 色谱条件 色谱柱：Waters XTerra RP18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈－水（0.28∶0.52），流速为0.8 ml·min-1；，检测波长为247 nm；灵敏度为2.000AUFS；柱温为35℃；进样量10 μl。理论板数按补骨脂素峰计算应不低于14000，补骨脂素和异补骨脂素的分离度R大于1.8。
　　2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取对照品补骨脂素和异补骨脂素约20 mg ，各置50 ml容量瓶中， 加入甲醇溶解并定容至50 ml，涡旋2 min，即得每1 ml中含补骨脂素0.44 mg和异补骨脂素0.40 mg的储备液，各吸取适量储备液混合稀释。
　　2.3 供试品溶液的制备 精密量取补骨脂酊1 ml，置50 ml容量瓶中， 加乙腈至刻度， 摇匀，作为供试品溶液。同法制备不含补骨脂素和异补骨脂素的空白样品溶液。 转贴于 　　2.4 HPLC方法专属性 分别取对照品溶液、供试品溶液、空白样品溶液适量进样。对照品溶液和供试品溶液中补骨脂素和异补骨脂素组分完全分离， 分离度R大于1.8，保留时间分别为14.326 min和15.259 min，无杂峰干扰测定。空白样品溶液在补骨脂素和异补骨脂素色谱位置处无吸收峰。见图1。
　　2.5 标准曲线的绘制 分别精密吸取0.44 g·L-1补骨脂素和0.40 g·L-1异补骨脂素的对照品溶液20 μl、40 μl、80 μl、160 μl、320 μl，放入同一10 ml容量瓶中，用乙腈分别稀释至刻度，取10 μl进样，以浓度（C）对应峰面积（A）进行线性回归。补骨脂素和异补骨脂素的回归方程如下。
　　补骨脂素：A1=－15426+102653C1，r＝0.9998，n＝5。
　　异补骨脂：A2=－6963+98991C2， r＝0.9999，n＝5。
　　结果表明：补骨脂素浓度在0.88～14.08 mg·L-1范围内，异补骨脂素浓度在0.80～12.80 mg·L-1范围内线性关系良好。图1 高效液相色谱图
　　峰1.补骨脂素；峰2.异补骨脂素
　　2.6 精密度实验 分别精密吸取补骨脂素和异补骨脂素的对照品溶液适量， 放入同一容量瓶并用乙腈稀释至刻度，按“2.1色谱条件”重复进样5次， 根据测定结果计算，浓度3.52 mg·L-1和14.08 mg·L-1补骨脂素的RSD分别为0.68％和0.46％；浓度3.20 mg·L-1和12.8 mg·L-1异补骨脂素的RSD分别为0.58％和0.41％。
　　2.7 稳定性实验 取同一对照品溶液，按“2.1色谱条件”进样，分别于0、1、2、4、8、12、24 h各时点进行测定，结果补骨脂素的RSD为1.37％，异补骨脂素的RSD为1.14％，表明样品溶液在24 h内基本稳定。
　　2.8 加样回收率实验 精密吸取已知含量（批号：080124）的样品适量，分别加入不同量的对照品溶液， 用乙腈稀释至刻度，每个浓度稀释2份进行测定，按“2.1色谱条件”操作，计算补骨脂素和异补骨脂素的回收率， 结果见表1。表1 补骨脂素和异补骨脂素的回收率
　　2.9 样品测定 精密吸取供试品溶液各0.1 ml， 用乙腈稀释至5 ml，按照“2.1色谱条件”各进10 μl，以峰面积带入回归方程计算样品的含量，结果见表2。 表2 样品中补骨脂素和异补骨脂素的含量
　　3 讨 论
　　采用反相高效液相色谱法测定补骨脂酊，曾用流动相甲醇－水（35∶65），甲醇－0.1％冰醋酸（55∶45），甲醇－0.1 mol·L－1磷酸盐缓冲液（55∶45）进行分离，结果有的不能完全分离，有的能分离但峰拖尾，分离效果不太理想，使用乙腈－水（0.28∶0.52）为流动相，分离结果较满意。
　　使用反相高效液相色谱法测定补骨脂酊制剂中补骨脂素和异补骨脂素的含量，方法简便、快速、准确， 可作为该制剂的质量控制方法。