【摘要】 目的 采用套管连接血管建立大鼠颈部心脏移植模型，观察移植心脏存活时间及病理改变，探讨该模型建立及手术方法的改进。方法 在低温和常规心肌保护下切取供心，分离受体右侧颈总动脉和颈外静脉，将供体的无名动脉和肺动脉分别与受体的颈总动脉和颈外静脉行套管连接。通过视诊和触诊观察移植心的搏动情况，于术后第1、3、5、7、9天及终末期等时间点分别取供心，送病理检查。结果 正式实验136例，术后复跳率100％，术后移植心脏存活时间大于48 h者125例，成功率92％，平均存活（7.16±2.47）天，其停跳高峰在移植后第7～9天。病理切片观察到排斥反应发生呈动态变化。结论 该方法操作简单，可一人操作，手术时间和供心热缺血时间显著缩短，该法可避免吻合口出血，提高血管通畅率。手术成功率明显提高。
【关键词】 心脏 移植 套管技 大鼠
Abstract:Objective To develop a new method of rat cervical heterotopic heart transplantation model by using cuff technique， and to evaluate the procedure by studying the survival time and the histopathological changes of the transplanted heart.Methods The donor heart was dissected at low temperature， with the myocardium protected in a routine way. The recipient′s right common carotid artery and external jugular vein were isolated and connected to the donor′s innominate artery and pulmonary artery respectively by cuff technique. The grafted heart was examined daily through palpation and inspection for heart beat， and was removed for histopathological eximnation on days 1， 3， 5， 7， 9 and end point.Results A total of 136 rat cervical heterotopic heart transplantation models were produced， the 48 h survival rate was 92% (125/136)， the survival time averaged (7.16±2.47) d ， although the 136 rats′ rebeating rate was 100%. Mostly the heart arrest happened between d7and d9. Histopathological examination showed that the rejection process developed dynamically.Conclusion This new procedure of rat cervical heart heterotopic transplantation with cuff technique is simple and can be completed by a single surgeon. The length of the procedure and the warm ischemic time of donor heart are obviously shortened. Complications， such as anastomotic leakage， can be avoided. The new cervical heterotopic heart transplantation model contributes a simple and useful tool to the scientific work of organ transplantation.
Key words: heart; transplantation; cuff technique; rat
本研究采用套管技术建立大鼠颈部心脏移植模型，动态观察移植心脏存活及病理学特征，旨在为心脏移植研究提供可靠的动物模型。
1 材料和方法
1．1 动物及材料仪器 健康雄性Wistar及SD大白鼠，近交系，受体为Wistar大白鼠，体重200～250 g ，供体为SD大白鼠，体重150～200 ｇ，由山东大学实验动物中心和徐州医学院实验动物中心提供。显微手术器械包(上海医疗器械厂)；自制鼠固定板2个；无影灯1台(上海医疗电子设备厂) ；1%戊巴比妥钠；体积分数为75%的乙醇；25×103 Ｕ/L肝素；2％罂粟碱；自制套管，由两部分组成，即套管体a和延长部b；颈总动脉套管，长1.6 mm，外径1.0 mm，内径0.6 mm；肺动脉套管，长1.8 mm，外径2.0 mm，内径1.4 mm。
1．2 实验动物模型制备 以1％戊巴比妥钠按40 mg/kg 腹腔内注射麻醉后，仰卧固定于固定板上，准备供体胸、腹部和受体颈部皮肤，常规1%活力碘消毒皮肤切口。
1．2．1 受体手术 皮下注射肝素2 mg/kg，自胸骨上缘至下颌骨下方做颈部正中切口，依次切开皮肤及皮下组织，显露右颈外静脉，结扎其属支，在颈外静脉第一个属支处套线暂不结扎颈外静脉主干，留牵引线备用。切除右侧颌下腺和胸锁乳突肌，为移植心脏准备足够的空间。游离右侧颈总动脉，尽量游离使之有足够的长度，罂粟碱浸泡后，小血管夹夹闭近端，距颈内、外动脉分叉处约0.5 cm结扎、切断颈总动脉，末端处用微型剪纵行剪开管壁1 mm，将动脉断端分成两部分，以供翻转时用。于颈总动脉末端缝一牵引线（8-0尼龙线），牵引颈总动脉通过套管，血管钳夹住套管的延长部分并固定，罂粟碱、肝素盐水冲洗显露颈总动脉末端管腔后，将颈总动脉断端翻转于套管之外，用5-0丝线结扎固定，备用。
1．2．2 供体手术 沿腹正中线切口进入腹腔，显露下腔静脉，注入肝素盐水 5 mg/kg ，全身肝素化，剪开部分下腔静脉壁放血，同时沿双侧腋前线开胸至锁骨，将整个胸前壁向上翻起，自膈下下腔静脉进针，针头越过膈肌后，快速注入5～6 ml冷停搏液，心脏停跳后，胸腔内置冰屑，分别游离左、右上腔静脉及下腔静脉，在其汇入心腔处用5-0丝线结扎并离断，切断左肺动脉和左支气管，结扎、离断左肺静脉。切断右侧支气管及右肺动脉，结扎切断右肺静脉，切断降主动脉，提起近端，沿降主动脉向上游离，分别切断左锁骨下动脉、左颈总动脉、右颈总动脉和右锁骨下动脉。摘取心脏，放入0～4℃盐水中修剪。剪开肺动脉末端的分叉，牵引肺动脉通过套管，将肺动脉末端翻转固定于套管外。剪开无名动脉末端的分叉，于无名动脉和左颈总动脉之间结扎主动脉弓，切除远端部分。至此，供心准备结束。
1．2．3 心脏移植 供心移植于受体的颈部。提起供心的无名动脉，将无名动脉套在备好的受体颈总动脉套管外，结扎固定。纵行剪开受体颈外静脉，切口的两侧及远端分别用小血管钳固定，将翻转好的供心肺动脉插入受体颈外静脉内，结扎固定（图1），分别剪除结扎远端的颈外静脉和套管的延长部分。开放动脉夹，移植心脏迅速充盈，在1 min内移植心脏自动复跳或由心室纤颤转为正常心律；移植心脏收缩后，膨胀的心脏迅速缩小，并由充盈时的紫红色转为正常颜色。
图1 连接完毕后的移植心脏
1．3 术后处理及观察 术后0.5～2 h大鼠清醒，能站立及饮水，单笼饲养，不用抗生素；术后1～2天喂2％糖盐水和酸化水，以后改为正常饲养。由于移植心脏仅位于右侧颈部皮下，通过视诊和触诊即可观察到移植心的搏动情况。按Abbott等［1］的标准：移植心脏术后早期心跳有力，心率150～250次／min，心脏有弹性且不硬胀，提示移植手术成功;心跳如果缓慢无力或心脏饱胀变硬或触不到心跳，则提示移植手术失败。随着时间延长，供心会因为排斥反应而逐步心跳乏力，直至停跳。为了便于观察移植心脏的功能变化，将移植心心功能分为5级［2］：4级，心率正常，节律规整；3级，心率和节律正常，但收缩力降低；2级，心率减慢或（和）节律不规整；1级，心脏收缩慢而弱；0级，无心肌收缩。
1．4 病理检查 分别于术后第1、3、5、7、9天及终末期等时间点各取4只供心，送病理学检查。观察淋巴细胞浸润情况，并同触诊、视诊比较，以判断排斥反应是否发生。
2 结 果
2．1 心脏移植情况 正式实验136例，术后移植心复跳率100％，术后移植心脏存活时间大于48 h者125例，存活率92％。失败原因主要是在分离主动脉和肺动脉间隔及动脉韧带时误伤肺动脉，或术中显微器械刺破血管、心脏复跳后出血；有时可能是右心回流不畅所致。手术平均时间为60 min，其中受体颈部手术时间为15 min，供心缺血时间20～30 min，吻合时间（热缺血）仅2～4 min。未经任何处理进行心脏移植的大鼠，供心存活时间为5～12天，平均存活（7.16±2.47）天，其停跳高峰在术后第7～9天。
2．2 病理学检查 病理大体解剖显示，移植心周围明显水肿和渗出，但没有脓液及明显的感染征象；供心与周围软组织有轻度粘连，心脏表面纤维化不明显。病理切片可清楚观察到排斥反应发生是动态变化的，其变化趋势表现为：①心肌水肿变性逐渐加重；②炎性细胞浸润由心外膜、心内膜、心肌顺序逐渐发展；③淋巴细胞，尤其是单核细胞浸润加重；④在术后第1、3天均未见明显心肌细胞坏死，自第5天开始，心肌细胞坏死增加，并逐渐加重。见图2～4。
当前，心脏移植研究模型存在两大问题:即长时间移植术中的缺血尤其是热缺血和移植后的持续功能存活时间。而前者直接对后者产生影响。这其中应用何种技术建立模型成为研究者所关注的热点。1964年，Abbott等［1］ 设计了一种大鼠腹腔异位心脏移植模型，其循环途径为将供心主动脉、肺动脉与受体肾血管水平以下的腹主动脉、下腔静脉吻合；因受体大血管被横断，下肢及盆腔器官血供及功能受损较大，并发症多，死亡率高。1969年，Ono等［3］改端端吻合为端侧吻合， 使下肢缺血、截瘫等并发症得以避免；然而Ono模型将供体心脏移植入受体腹腔，其创伤大， 吻合技术的难度较大，失血多，手术时间长，术后粘连严重，局部炎性反应较强，从而严重影响其作为移植排斥反应模型的实用性和准确性。部分学者将不同实验室得出不同研究结论的原因归结于这种模型的炎性反应与排斥反应的互相干扰［4-5］。
本研究采用套管技术建立心脏移植模型，简化了手术过程，损伤轻，供心缺血时间短，避免了手术缝合所引起的并发症。 供心血液循环途径是：受体颈总动脉→供心无名动脉→供心升主动脉→冠状动脉→心肌→冠状静脉→右心房→右心室→肺动脉→受体颈外静脉。供心有充分的血供。
本模型具有以下优点。①易于暴露：颈部异位移植，只需切开分离颈部皮肤及皮下组织，摘除舌下腺、一侧胸锁乳突肌即可有足够空间供手术。此时颈浅静脉已完全暴露，颈动脉也只需切断一侧胸锁乳突肌，分离血管鞘即可。②血管处理简单，吻合质量高：以前许多手术方法多是采用吻合技术［1，4］，操作较为复杂，而该手术方式将心脏移植实验手术大大简化，该法不需要缝合，避免了吻合口出血、梗阻、狭窄等主要并发症，通畅率高达100％。③采用供、受体交替手术的顺序，进一步缩短了供心的缺血时间。因血管连接的简化，供心热缺血时间明显缩短，仅2～4 min。④血管相接处为光滑而完整的血管内膜，对血管损伤轻，避免了血管内皮损伤而引起的并发症。⑤术后观察方便。供心位于颈部皮下，一般情况下仅需视诊即可确定供心的功能情况。避免了反复刺激大鼠致内分泌的改变，保证了实验的稳定性。⑥手术损伤轻，失血少，术后恢复快。术中术后均不用抗生素，仅在术后2天内喂以酸化水和2％的糖盐水。⑦手术创伤小，有再次手术机会。整个手术在颈部一侧进行，手术视野3.0 cm×3.0 cm，不涉及大血管及大脏器，亦不会因蒸发而致血容量减少，即使供心不复跳，亦不会致受体死亡。⑧污染机会少:不进腹腔，操作时间短，大大减少了污染机会。
本组动态病理切片检查结果提示，供心局部出现以淋巴细胞浸润为主的病理变化，从第2天即有轻度淋巴细胞浸润，至第8天为高峰，整个过程中伴随出现心肌细胞水肿变性、外膜增生、内膜变厚，当排斥反应发生时， 炎性细胞浸润由心外膜、心内膜、心肌顺序逐渐发展，心肌细胞出现明显的坏死性改变，这与供心存活时间一致。说明本移植模型与Ono移植模型一样，具有相同的移植排斥反应以及排斥反应发生规律、高峰时期、病理特征等，可以作为移植排斥反应的动物模型。
【参考文献】
［1］ Abbott CP， Lindsey ES， Creech O Jr， et al. A technique for heart transplantation in the rat ［J］． Arch Surg，1964，89:645-652.
［2］ Mottram PL， Smith JA， Mason A， et al. Electrocardiographic monitoring of cardiac transplants in mice ［J］． Cardiovasc Res，1988，22(5):315-321.
［3］ Ono K， Lindsey ES. Improved technique of heart transplantation in rats ［J］． J Thorac Cardiovasc Surg，1969，57(2)：225-229.
［4］ Asfour B， Hare JM， Kohl T， et al. A simple new model of physiologically working heterotopic rat heart transplantation provides hemodynamic performance equivalent to that of an orthotopic heart ［J］. J Heart Lung Transplant，1999，18(10):927-936.
［5］ Blanchard J， Massad M， Sekosan M， et al. A new rat model to study the correlation of cardiac and skeletal muscle allograft rejection ［J］. Microsurgery，1998，18(7):406-409.