【摘要】 目的 研究室旁核（paraventricular nucleus， PVN）内微量注射催产素（oxytocin， OT）对大鼠胃缺血/再灌注(gastric ischemia/reperfusion， GI/R)后胃黏膜细胞胃泌素表达的影响。方法 采用夹闭大鼠腹腔动脉30 min，去除动脉夹再灌注1 h的GI/R损伤模型，于单侧PVN微量注射OT。肉眼计数胃黏膜损伤指数，并运用免疫组化实验技术观察了PVN微量注射OT对胃黏膜细胞胃泌素蛋白表达的影响。结果 PVN微量注射OT可明显减轻GI/R损伤；PVN内微量注射OT能明显减少GI/R后胃黏膜细胞胃泌素的表达，侧脑室给予OT特异性拮抗剂atosiban后阻断OT对大鼠GI/R损伤的保护作用并使胃泌素的表达增加。结论 PVN微量注射OT后对GI/R损伤具有显著的保护作用，这种保护作用在脑内是由OT受体介导的，在胃黏膜局部与抑制胃黏膜细胞胃泌素的表达有关。
【关键词】 胃缺血/再灌注 室旁核 催产素 胃泌素
Abstract: Objective To observe the effect of microinjection of oxytocin (OT) into paraventricular nucleus (PVN) on gastric ischemia/reperfusion (GI/R) injury and gastrin expression. Methods GI/R injury was induced in rats by clamping the celiac artery for 30 min and then reperfusing for 1 h. A cannula was inserted into the unilateral PVN for microinjection of OT. The gastric mucosal injury index was counted grossly. The expression of gastrin in rat gastric mucosa was examined by immunohistochemistry. Results Microinjection of OT into PVN attenuated the gastric mucosal injury related to GI/R， and significantly decreased the expression of gastrin protein in gastric mucosa. The ptotective effects of OT could be blocked by pretreatment with atosiban， an OT receptor antagonist， into the lateral cerebral ventricle. Conclusion Microinjection of OT into PVN can significantly protect against GI/R injury. These central effects of OT are mediated via its receptors. The local mechanism at the gastric mucosa may involve the inhibition of gastrin expression.
Key words: gastric ischemia/reperfusion; paraventricular nucleus; oxytocin; gastrin
胃泌素是一种具有广泛的生理和病理作用的胃肠激素，由胃窦区G细胞释放，能够刺激壁细胞分泌胃酸增多，刺激肠嗜铬样（enterochromaffin-like， ECL）细胞释放大量组胺引起组织炎症和血管通透性增加，胃泌素还可抑制幽门括约肌的紧张性，使其功能失调而引起胆汁返流，从而引起胃肠黏膜的炎症和溃疡等损害。但胃泌素有时也具有生长因子的作用，促进胃黏膜的生长［1］。大鼠胃缺血/再灌注（gastric ischemia/reperfusion， GI/R）是目前常用的一种研究胃损伤的模型，其发生与多种因素有关，如胃黏膜内氧自由基生成过多、内皮素水平升高、胃微循环障碍、白细胞浸润、一氧化氮释放、胃酸分泌增多、前列腺素合成减少等［2］，而有关胃泌素在其中作用的研究较少。此外，下丘脑室旁核(paraventricular nucleus， PVN)对胃酸分泌、胃运动、胃电活动均有广泛的调节作用。PVN内包含多种神经元，可分泌多种神经递质，其中包括催产素（oxytocin， OT）能神经元及其受体。PVN以及OT能神经元及其受体参与对胃黏膜损伤的调节［3］，刺激PVN及PVN内微量注射OT能够减少胃酸分泌，减轻胃溃疡［4］;我们以前的研究发现电刺激PVN可减轻GI/R损伤［5-6］。那么，PVN内微量注射OT对GI/R损伤是否有影响呢？这种影响是否通过胃黏膜局部胃泌素所介导呢？因此，本研究通过建立GI/R模型，应用核团微量注射、免疫组化等方法，探讨了PVN内微量注射OT对GI/R损伤的影响及胃泌素在其中的作用机制。
1 材料和方法
1.1 试剂 OT购自上海第一生化药业有限公司；atosiban购自深圳翰宇生物工程有限公司；胃泌素兔多克隆抗体、PowerVision二步法免疫组化检测系统、DAB显色试剂盒、枸橼酸盐缓冲液、多聚赖氨酸溶液购自北京中杉生物技术有限公司；其他试剂均为市售化学纯。
1.2 实验动物及分组 健康成年Sprague-Dawley(SD)大鼠(220～240 g)，雌雄不拘，由徐州医学院实验动物中心提供(使用许可号:SYXK［su］2002-0038)。实验前禁食24 h，自由饮水。将SD大鼠随机分为5组，每组6只：①单纯GI/R组（GI/R组）;②PVN内微量注射生理盐水0.3 μl后进行GI/R组（vehicle组）;③PVN内微量注射OT 600 ng/0.3 μl后进行GI/R组（OT组）;④侧脑室内微量注射atosiban 1.2 μg/5 μl后再进行PVN内微量注射OT 600 ng/0.3 μl，然后制备GI/R组（OT+atosiban组）;⑤侧脑室内微量注射atosiban 1.2 μg/5 μl后进行GI/R组（atosiban组）。
1.3 PVN或侧脑室微量注射 动物在麻醉下(10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射)固定于脑立体定位仪上，按照Paxinos和Watson脑图谱［7］及我们以前的方法［5］定位PVN(坐标：AP 1.5 mm，R 0.4 mm，H 7.7～7.8 mm，门齿瓣低于耳间连线3.3 mm)和侧脑室（坐标：AP 1.0 mm，L 1.5 mm，H 4.5 mm），在2 min内将OT 600 ng/0.3 μl微量注射到PVN或将atosiban 1.2 μg/5 μl注射到侧脑室。vehicle组注射等体积的生理盐水。
1.4 GI/R动物模型的制备 按Wada等［8］方法进行。实验大鼠水合氯醛麻醉后，仔细分离腹腔动脉与周围组织，用小动脉夹夹闭腹腔动脉30 min后去除动脉夹恢复血流再灌注60 min。实验结束后取胃计数胃黏膜损伤指数。
1.5 胃黏膜损伤指数测定 参照Guth等［9］方法加以改进。以腺胃区局限于胃上皮的点状糜烂、溃疡、出血灶的长度累积计分：正常为0分；损伤小于1 mm计1分；1～2 mm计2分；～3 mm计3分；余类推。损伤宽度超过1 mm时，分数加倍。每组大鼠损伤分数的平均值为胃黏膜损伤指数。测量完胃黏膜损伤指数后将胃组织在10%中性甲醛溶液内固定，石蜡包埋切片后用于免疫组化染色。
1.6 免疫组化染色方法 胃泌素染色步骤按照北京中杉生物技术有限公司提供的PowerVision二步法免疫组化检测系统进行。DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。光镜下观察到胞质或胞核内有棕色颗粒者即为阳性细胞。用Image-Pro Plus 图像分析系统对阳性细胞数进行半定量分析。以高倍视野下阳性细胞面积(area)、平均光密度(mean optical density， MOD)、累积光密度（integrated optical density， IOD）作为分析指标。对照实验以PBS缓冲液代替一抗。每例3张间断切片，每张切片随机选取10个视野，取平均值。
1.7 统计学处理 数据以±s表示，多组间比较采用完全随机设计方差分析法（ANOVA）。P＜0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 PVN内微量注射OT对GI/R 1 h后胃黏膜损伤的影响 首先我们观察到GI/R 1 h可引起胃黏膜明显损伤，其胃黏膜损伤指数为143.6±40.0(GI/R组);PVN微量注射溶剂（生理盐水）后，GI/R 1 h仍可引起明显的胃黏膜损伤，其损伤指数为139.6±35（vehicle组），与GI/R组差异无显著性(P&>0.05)；PVN微量注射OT 600 ng后，可显著减轻GI/R 1 h后的胃黏膜损伤，胃黏膜损伤指数为29.67±13.37(P&<0.01，vs. vehicle组)。
然后观察了PVN微量注射OT对GI/R损伤的保护效应是否由中枢内的OT受体介导。在PVN微量注射OT和GI/R之前，侧脑室注射OT受体拮抗剂atosiban。结果表明，atosiban 1.2 μg可完全阻断OT(600 ng)对GI/R损伤的保护效应，胃黏膜损伤指数为136.4±31.1(P&<0.01 vs. OT组)。而侧脑室单独注射OT受体拮抗剂atosiban并不影响GI/R损伤，胃黏膜损伤指数为147±51.2(P&>0.05 vs. GI/R组)。
2.2 PVN内微量注射OT对GI/R后胃黏膜胃泌素表达水平的影响 为了阐明胃泌素是否介导OT的保护效应，我们采用了免疫组化方法观察了各组胃黏膜胃泌素蛋白表达水平的变化。结果发现，PVN微量注射OT(600 ng)可明显减少GI/R 1 h后胃泌素蛋白的表达水平(P&<0.01)，经Image-Pro Plus系统分析OT组胃泌素表达阳性细胞面积、MOD、IOD分别是vehicle组的29.06%、53.64%、26.47%，而atosiban可取消OT的这种效应，胃泌素蛋白的表达水平升高，与vehicle组差异无显著性(P&>0.05，图1、2)。
3 讨 论
胃泌素既是一种胃肠激素，又是中枢和外周神经递质。它主要由胃窦部G细胞分泌，此外，在胃底、十二指肠、空肠、人胰岛的D细胞、颊黏膜、舌、食管、中枢神经系统也含有胃泌素。胃泌素可促进胃酸分泌和黏膜的生长，促进胃肠道的运动，松弛幽门括约肌、胆道口括约肌和回盲部括约肌，促进胃及上部肠道黏膜细胞的分裂增殖，使胃黏膜增厚。胃泌素促进多种参与黏膜细胞增殖、分化和迁移的基因表达上调，从而参与黏膜上皮细胞维护和重构［10］。由于胃泌素促进胃酸分泌和组胺的释放，因此认为胃泌素参与胃黏膜损伤的过程，是一个重要的致损伤因素；但也有文献报道外源性或内源性胃泌素在100%乙醇灌胃引起的胃损伤中起保护作用［11］。可见，胃泌素对胃黏膜损伤以及修复过程均有调节作用。本实验显示，GI/R后伴随着胃黏膜损伤的产生，胃黏膜细胞有大量的胃泌素表达，PVN内给予OT在明显减轻GI/R损伤的同时，胃黏膜细胞胃泌素的表达也明显减少，而OT受体拮抗剂可以阻断OT对胃黏膜的保护作用，并使胃黏膜细胞胃泌素的表达增多。因此，我们认为，胃泌素参与了GI/R损伤过程以及PVN内给予OT后对GI/R损伤的保护作用。
综上所述，我们可以得出以下结论：PVN内注射OT对GI/R损伤具有显著的保护作用；这种保护作用在中枢是由OT受体介导的，在胃黏膜局部是通过增加胃黏膜细胞胃泌素的表达、抑制胃酸分泌来实现的。
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