【摘要】 目的 构建增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein， EGFP)标记的L型电压门控钙通道(L-type voltage-gated calcium channels， L-VGCCs) α1C亚基羧基末端肽段(CT，1587-2169)的真核表达载体，并在COS-7细胞中表达。方法 采用RT-PCR方法扩增CT的cDNA，克隆至真核表达载体pcDNA3.1；采用PCR方法扩增标签蛋白EGFP的cDNA，克隆至重组体pcDNA3.1-CT，EGFP位于CT的羧基末端；采用脂质体转染法将重组体pcDNA3.1-CT-EGFP转染COS-7细胞，通过荧光显微镜和免疫印迹等方法检测重组体的表达。结果 扩增了CT和EGFP的cDNA；构建的pcDNA3.1-CT-EGFP真核表达载体经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性；荧光显微镜下转染重组质粒的COS-7细胞中观察到绿色荧光，免疫印迹分析显示pcDNA3.1-CT-EGFP转染组有明显条带。结论 成功构建pcDNA3.1-CT-EGFP真核表达载体，并且在COS-7细胞中得到表达。
【关键词】 L-型电压门控钙通道 α1C亚基 克隆 表达
Abstract:Objective To construct and express in COS-7 cells the enhanced green fluorescent protein (EGFP) tagged carboxyl terminal sequence (CT， 1587-2169) of L-type voltage-gated calcium channel α1C subunits.Methods The CT cDNA was amplified by RT-PCR and cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1. EGFP cDNA was amplified by PCR and cloned into pcDNA3.1-CT recombinant. EGFP was tagged to the C-terminus of the full-length CT. The recombinant was transfected to COS-7 cells by the method of lipofection and the protein expression was evaluated by fluorescence microscopy and immunoblot analysis.Results CT cDNA and EGFP cDNA were cloned. The pcDNA3.1-CT-EGFP recombinant constructed was verified by restriction endonuclease digestion and sequencing. Green fluorescence was shown in COS-7 cells transfected with the recombinant. The immunoblot analysis displayed a distinct band in the pcDNA3.1-CT-EGFP transfected group.Conclusion pcDNA3.1-CT-EGFP recombinant is successfully constructed and can be expressed in COS-7 cells.
Key words: L-type voltage-gated calcium channels; α1C subunits; clone; expression
神经元胞内Ca2+超载是缺血性脑损伤的关键因素，电压门控钙通道(voltage-gated calcium channels， VGCCs)是介导Ca2+内流的主要方式之一［1］。L型电压门控钙通道(L-VGCCs) 广泛分布于哺乳动物中枢神经系统［2-3］，当神经元细胞膜除极时开放，胞外的钙离子流入胞内，参与胞内钙稳态和神经兴奋性的调控，与突触可塑性［4］、基因表达［5-6］、激素分泌［7］等多种神经元生理过程有关。
中枢神经系统L-VGCCs是由α1、β、α2、δ亚基组成的糖基化多肽复合体，α2亚基位于胞外，α1和δ亚基为跨膜亚基，β亚基位于胞内。其中α1亚基是形成离子通道的主要功能亚基，其他亚基主要起调节作用。神经型L-VGCCs 的α1亚基主要是α1C和α1D亚型［8］。α1C(Cav1.2)亚基主要分布在海马、纹状体、大脑皮质等对缺血敏感脑区的神经元胞体和近端的树突［8］，其位于胞内的C端包含多个功能基序和结构域，有EF手基序(EF hand motif)、1-8-14基序(1-8-14 motif)、LA 基序(LA motif)、CB基序(calmodulin-binding motif， CB motif)、C端结合区、富含脯氨酸结构域(proline-rich domain， PRD)和C端抑制性结构域等，上述基序和结构域通过与其他信号分子相互作用而调控通道的功能［1］。本研究构建增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein， EGFP)标记的α1C亚基羧基末端肽段(含1587-2169位氨基酸残基，简称CT)的真核表达载体pcDNA3.1-CT-EGFP，为进一步研究α1C亚基在缺血性脑损伤中的作用及机制奠定基础。
1 材料和方法
1.1 载体、菌株和细胞株 质粒pcDNA3.1(+)购自Invitrogen公司，pGEM-T 载体购自Promega公司；大肠杆菌JM101、COS-7细胞均为本实验室保存。
1.2 主要试剂 总RNA提取试剂盒、PCR Master Mix试剂盒、DNA 纯化试剂盒、T4DNA连接酶、限制性内切酶EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ和Apa Ⅰ为Promega公司产品；Takara Ex Taq试剂盒为Takara公司产品；Lipofectamine 2000和1kb Plus DNA Ladder为Invitrogen公司产品；DMEM购自GIBCO公司；新生牛血清购自杭州四季青生物技术有限公司；鼠抗EGFP抗体购自Clontech公司；碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗鼠二抗购自Sigma公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.3 引物设计
1.3.1 CT cDNA扩增的引物设计 根据Genbank中的大鼠α1C的cDNA序列(NM012517)，以4759-4761位编码甲硫氨酸的ATG作为扩增序列的起始密码子，以6507位作为扩增序列结束的位置，设计特异性上下游引物(下划线为酶切序列)：
P1: GCCAAGCTTATGTTCAATGCTACACT (Hind Ⅲ)；
P2: GAATTCGTTGCTGACATAGGACCTGC (EcoR Ⅰ)。
1.3.2 EGFP cDNA扩增的引物设计 根据EGFP的cDNA序列设计特异性上下游引物(下划线为酶切序列)：
P3: GAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAG (EcoR Ⅰ)；
P4: GGGCCCCTACTTGTACAGCTCGTC (Apa Ⅰ)。
1.4 总RNA提取和RT-PCR扩增CT cDNA SD雄性大鼠(清洁级， 由徐州医学院实验动物中心提供)，RNA提取试剂盒提取大鼠海马总RNA。以提取的总RNA为模板，使用Takara Ex Taq试剂盒，先以寡聚T作为引物进行反转录，反应参数为：室温10 min， 1个循环，42℃ 1 h，1个循环；冰水中2 min，1个循环。然后以P1和P2为上下游引物进行PCR，反应参数为：94℃ 4 min，1 个循环； 94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 3 min，28个循环。RT-PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.5 pcDNA3.1-CT真核表达载体的构建 1%低熔点琼脂糖凝胶电泳、DNA纯化试剂盒回收纯化目的基因片段，然后连入pGEM-T载体，筛选阳性重组子测序分析，DNA序列分析委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行。
将测序正确的重组子分别经Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ双酶切，亚克隆至pcDNA3.1载体。转化感受态细胞JM101，提取的质粒经Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ双酶切鉴定重组子， 阳性重组子进行序列测定。
1.6 pcDNA3.1-CT-EGFP真核表达载体的构建 以我室构建的pcDNA3.1-EGFP(上、下游的酶切位点均为EcoR Ⅰ)为模板，使用PCR Master Mix试剂盒，以P3和P4为上下游引物进行PCR，反应参数为: 94℃ 2 min，1个循环；94℃ 30 s，60℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 7 min，1个循环。RT-PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。参照1.5方法连入pGEM-T载体。
将测序正确的pcDNA3.1-CT与pGEM-T-EGFP分别用EcoR Ⅰ/Apa Ⅰ进行双酶切，1%低熔点琼脂糖凝胶回收纯化酶切后的pcDNA3.1-CT和EGFP cDNA，将两者连接，参照1.5方法转化感受态细胞JM101，筛选，提取质粒，Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ/Apa Ⅰ三酶切鉴定与测序。
1.7 COS-7细胞培养与质粒转染 COS-7细胞以含100 ml/L 新生牛血清的Dulbecco改良培养基(Dulbecco′s modified eagle media， DMEM)培养，待细胞密度至90%～95%时，以脂质体转染法(Lipofectamine 2000)将重组质粒pcDNA3.1-CT-EGFP及空质粒pcDNA3.1分别转染入COS-7细胞中，用荧光显微镜观察荧光情况，36 h后收集细胞，超声破碎，以改良Lowry法测定蛋白质浓度。
1.8 免疫印迹 蛋白质样品(100 μg)经7.5% SDS-PAGE分离，电转至硝酸纤维素膜(NC 膜)上。NC膜在含3% BSA的封闭液中室温孵育3 h后，鼠抗EGFP抗体 4℃孵育过夜，AP标记的二抗室温孵育2 h，NBT/BCIP中显色，扫描膜上显色条带。
2 结 果
2.1 CT cDNA的扩增 根据α1C的cDNA序列(Genbank， NM012517)，以大鼠海马总RNA为模板，用设计的特异性引物进行CT cDNA的扩增。琼脂糖凝胶电泳显示，扩增出的cDNA与目的基因片段大小(1749 bp) 相符(图1)。
图1 RT-PCR产物电泳图
M. DNA Marker; CT. RT-PCR产物
2.2 pcDNA3.1-CT真核表达载体的构建与鉴定 阳性重组子pGEM-T-CT测序分析结果显示，CT cDNA序列与Genbank NM012517中4 759-6 507序列相比，有2个核苷酸不同(5877和5934)，属于单核苷酸多态性位点，但表达的多肽氨基酸序列是完全一致的。将测序正确的pGEM-T-CT重组子用Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ双酶切，回收目的片段，与经同样双酶切的pcDNA3.1载体连接。琼脂糖凝胶电泳显示，筛选出的阳性重组子经Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ双酶切后有2条DNA条带，其大小分别与载体pcDNA3.1 (5400 bp) 和CT cDNA(1749 bp)一致(图2)，且测序结果正确。结果表明CT的cDNA已成功克隆至pcDNA3.1真核表达载体。
2.3 pcDNA3.1-CT-EGFP真核表达载体的构建 将扩增的EGFP cDNA(结果未显示)连入pGEM-T载体，筛选阳性重组子，将测序正确的pcDNA3.1-CT与pGEM-T-EGFP分别用EcoR Ⅰ/Apa Ⅰ进行双酶切，1%低熔点琼脂糖凝胶回收纯化酶切后的pcDNA3.1-CT和EGFP cDNA，将两者连接。琼脂糖凝胶电泳显示，筛选出的阳性重组子经Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ/Apa Ⅰ三酶切后有3条DNA条带，其大小分别与载体pcDNA3.1(5400 bp)、CT cDNA(1749 bp)和EGFP cDNA(720 bp)相一致(图3)，且测序结果正确。
M. DNA Marker; CT. pcDNA3.1-CT Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ双酶切产物
图3 pcDNA3.1-CT-EGFP的三酶切产物电泳图
M. DNA Marker; CE. pcDNA3.1-CT-EGFP Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ/Apa Ⅰ三酶切产物
2.4 真核表达载体在COS-7细胞中的表达 将pcDNA3.1和pcDNA3.1-CT-EGFP分别以脂质体介导法转染COS-7细胞，荧光显微镜下，pcDNA3.1-CT-EGFP转染组24 h后开始呈现明显绿色荧光，并不断加强(结果未显示)。36 h后收集未转染组和转染组COS-7细胞，样品经SDS-PAGE分离后，以鼠抗EGFP抗体进行免疫印迹分析。结果显示，pcDNA3.1-CT-EGFP转染组可检测到明显电泳条带(图4)。以上结果表明，构建的EGFP融合的CT真核表达载体在COS-7细胞中得到了高效表达。
图4 未转染组和转染组COS-7细胞
免疫印迹分析图
1.COS-7； 2.pcDNA3.1； 3.pcDNA3.1-CT-EGFP
3 讨 论
短暂性全脑缺血可诱发一系列病理性反应，最终导致海马、皮质等敏感性脑区的神经元损伤。L-VGCCs 通过介导Ca2+内流，在短暂性全脑缺血及再灌注的信号转导过程中扮演着重要的角色［1，9-10］。α1C亚基作为神经型L-VGCCs的主要功能亚基，通过膜内疏水的C端所包含的多个功能结构域与其他信号分子相互作用而调控通道功能［1］。针对其信号转导机制进行深入研究，有可能发现新的缺血性脑损伤的治疗药物。
本实验以海马中总RNA为模板，设计CT的特异性上下游引物，通过RT-PCR方法较灵敏和特异性地扩增到目的片段。测序分析结果表明，目的序列中存在着2个单核苷酸多态性位点。在CT cDNA羧基末端插入EGFP cDNA，构建EGFP融合的CT真核表达载体，为观察蛋白表达情况提供了重要的依据。EGFP 融合的CT真核表达载体的成功构建和表达，为我们进一步在体内外研究α1C亚基的生物学功能及调节机制奠定了基础。
【
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