钌(Ⅱ)配合物与DNA相互作用的光谱分析

【摘要】 目的 设计合成一个钌(Ⅱ)多吡啶配合物［Ru(dmp)2(dpip)］2+（dmp=1，10邻菲咯啉，dpip=2(6，9二氧环己环苯基)咪唑并［4，5f］邻菲咯啉），研究该配合物与DNA的相互作用。方法 采用元素分析、质谱和1H NMR对其进行表征，用电子吸收光谱、黏度测试、DNA熔点变化和圆二色谱研究配合物与DNA的作用。结果与结论 所合成的配合物结构得到确证，该配合物与DNA之间通过插入作用结合。
【关键词】 钌(Ⅱ)多吡啶配合物 DNA 电子吸收光谱 元素分析 圆二色谱
Abstract:Ruthenium (Ⅱ) polypyridyl complex ［Ru(dmp)2(dpip)］2+ (dpip=2(6，9dioxanophenyl)imidazo［4，5f］［1，10］phenanthroline， dmp=2，9dimethyl1，10phenanthroline) has been synthesized and characterized by element analysis， ESMS and 1H NMR. The interactions of the complex with DNA were investigated by electronic absorption spectra， thermal denaturation， viscosity measurement and circular dichroism. The results show that the complex ［Ru(dmp)2(dpip)］2+ intercalates into the DNA base pair via the intercalative ligand.
　　Key words:ruthenium (Ⅱ) polypyridyl complex; thermal denaturation; DNAbinding
　　 在过去10年，钌（Ⅱ）多吡啶配合物和DNA作用的研究成为生物无机化学一个非常活跃的领域，理解小分子化合物与DNA作用机理，有助于人们设计新的抗肿瘤药物和高灵敏度的光谱探针及诊断试剂［1］。随着对金属配合物与DNA作用的深入研究，现在人们普遍认识到小分子化合物与DNA的非共价结合有静电作用、面式结合和插入结合3种作用机理。由于钌(Ⅱ)多吡啶配合物具有丰富的光化学、光物理、电化学性质，因此可以利用电子吸收光谱和荧光光谱的变化来判断配合物与DNA的结合模式。
　　本文设计合成了配合物［Ru(dmp)2(dpip)］(ClO4)2 (dmp=2，9二甲基1，10邻菲咯啉，dpip=2(6，9二氧环己环苯基)咪唑并［4，5f］邻菲咯啉)，合成路线见图1，对其结构进行了表征，并对配合物与DNA相互作用的机理进行了研究。 图1 配体及配合物合成路线
　1 实验部分
　　1.1 试剂和仪器
　　 所用化学试剂均为分析纯，使用前未经进一步纯化。小牛胸腺DNA购自华美公司，配合物用5 mmol/L TrisHCl，50 mmol/LNaCl(pH=7.2) 缓冲溶液配制。
　　 LCQ电喷雾质谱仪(ESMS， Finnigan)，PerkinElmer 240 元素分析仪，Bruker DRX500型核磁共振仪，Shimadzu UV2501 PC型紫外可见光谱仪，Ubbelodle黏度测定仪，JASCO J725型圆二色谱仪。
　　1.2 实验方法
　　 紫外可见吸收光谱实验中，在参比池和样品池中分别加入等量的DNA以消除DNA本身的吸收，当配合物的电子吸收光谱不再变化，此时吸收滴定达到饱和。
　　 黏度测试是在（28±0.1） ℃温度下，DNA溶液浓度固定，配合物的浓度不断增加，测定DNA溶液的黏度随着配合物浓度的变化。 配合物［Ru(dmp)2(dpip)］(ClO4)2与DNA结合常数根据下列方程求得［2-4］
　　(εa–εf)/(εb-εf)=
　　(b-(b2–2K2Ct［DNA］/s)1/2)/(2KCt) (1)
　　b=1+KCt+K［DNA］/2s (2)
　　εa， εf ，εb分别是配合物与DNA结合，自由配合物和配合物与DNA结合达到饱和时的摩尔吸光系数，K为结合常数，Ct为配合物的浓度，s为配合物与DNA的结合位置大?２饬筐ざ仁保露裙潭ㄔ?28±0.1) ℃。测试液配制方法：固定DNA的浓度，逐渐增加配合物的浓度。相对黏度按下式计算［5］：
　　η=(t–t0)/t0
　　式中，t0为缓冲溶液流经毛细管所需时间，t为DNA溶液（含不同浓度的配合物）流经毛细管所需时间。以 (η/η0)1/3对结合比率r(r=［Ru］/［DNA］)作图， η0为未加配合物的溶液的相对黏度。
　　DNA熔点测定实验中，TrisHCl溶液作为参比溶液，而DNARu(Ⅱ)溶液熔点测定，则以配合物作为参比溶液。
　　1.3 配合物的合成与表征
　　 配合物［Ru(dmp)2(dpip)］2+按文献［6］的方法合成，产率66%。元素分析：计算值（%），C 54.98，H 3.55， N 10.44； 实测值（%），C 54.96，H 3.58，N 10.46。1H NMR (DMSOd6)δ：8.91 (d，2H， J=8.5 Hz)， 8.83 (d， 2H，J=8.6 Hz)， 8.44 (t，4H)， 8.24 (d，2H，J=8.5 Hz)，7.97 (d，2H，J=8.4 Hz)， 7.73(d，2H，J=8.0 Hz)，7.46 (t，2H)，7.37 (d，2H，J=8.6 Hz)，7.32 (d，2H，J=7.8 Hz)，7.06 (d，1H，J=8.4 Hz)，4.14 (d， 4H， J=7.8 Hz)，1.97(s，6H)，1.72(s，6H)。ESMS(CH3CN)：m/z 970.54 (［MClO4］+)，870.47 (［M2ClO4H］+)，435.60 (［M2ClO4］2+)。
　　2 结果与讨论
　　2.1 配合物与DNA相互作用的电子光谱研究
　　 电子吸收光谱是研究小分子化合物与DNA相互作用的常用方法。通常当小分子化合物以插入方式进入DNA双螺旋碱基对之间时，其吸收光谱表现出峰位的红移及减色效应。

配合物与DNA作用前后的吸收光谱如图2所示。图2表明随着小牛胸腺DNA加入，配合物的电子吸收光谱发生减色和一定程度红移，金属到配体电荷跃迁（MLCT）峰(468 nm)，在室温时减色率为16.7%，红移4 nm，在271 nm处的跃迁，其减色率高达25.6%，这是因为配合物的插入配体插入到DNA碱基对之间，与碱基对发生π电子堆积后，其π*空轨道与碱基的π电子轨道发生地耦合，能级下降，从而导致π-π* 跃迁能量减小，产生红移；同时，耦合后的π轨道因部分填充电子，使π-π* 跃迁几率减小，产生减色效应；配合物与DNA作用的结合常数为K=9.96 × 104 (mol/L)-1(s=0.6)，大于通过插入与DNA作用的配合物与DNA的结合常数［1.1 × 104 ～ 4.8 × 104 (mol/L)-1］ ［7］，这一结果说明配合物与DNA之间可能通过插入作用结合。
　　2.2 黏度测试
　　 黏度测试是判断配合物与DNA作用方式的最有效的方法之一。配合物与小牛胸腺DNA以部分插入方式与DNA结合时，DNA溶液的黏度降低；以静电或沟面方式结合时，DNA溶液的黏度变化不大；而以插入方式结合时，DNA溶液的黏度增加。图3是配合物［Ru(bpy)2(dppz)］2+和 ［Ru(dmp)2(dpip)］2+与DNA作用黏度变化图。结果表明，［Ru(bpy)2(dppz)］2+是典型的DNA插入试剂，与DNA溶液作用时黏度明显升高，［Ru(dmp)2(dpip)］2+与DNA作用情况类似［Ru(bpy)2(dppz)］2+，所以配合物［Ru(dmp)2(dpip)］2+与DNA也是以插入方式结合。
　　2.3 DNA熔点测定
　　 DNA的熔点变化被认为是研究金属离子与DNA作用强弱的重要手段，当溶液的温度升高，双螺旋DNA逐渐转化为单螺旋，同时产生减色效应。图4表明在DNA熔点测定实验中，当［Ru］/［DNA］=1∶5(［DNA］=80 μmol/L)时， DNA的熔点升高为5.8 ℃，比较配合物［Ru(dmp)2(dpip)］2+与DNA作用的熔点变化值与经典插入试剂［8，9］与DNA作用的熔点变化值，说明配合物［Ru(dmp)2(dpip)］2+与DNA之间以较强的作用力结合。图4 存在配合物(●)和单独DNA(■)时DNA的熔点测定

　　2.4 平衡透析与CD光谱研究
　　 由于DNA结构存在左手和右手构型，当手性分子与DNA作用时，就存在立体选择性结合，即在圆二色谱光谱中得到正峰和负峰。图5为DNA在配合物［Ru(bpy)2(dpip)］2+溶液中经24 h透析后，透析液在紫外区的CD光谱图。图中显示，在272 nm和258 nm附近分别出现正峰和负峰，说明配合物与DNA之间存在立体选择性作用。
　　 3 结 论
　　 本文合成了一个新的钌(Ⅱ)多吡啶配合物［Ru(dmp)2(dpip)］2+，用元素分析、质谱和1HNMR进行表征，通过电子吸收滴定、黏度和熔点变化实验研究配合物与DNA作用，结果表明配合物［Ru(dmp)2(dpip)］2+与DNA之间以较强的结合力通过插入作用结合。

参考文献

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