CYP2C19基因与药物代谢有关性分析进展

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　　　　　　作者：杜红丽 王靖方 崔建勋 凌飞 魏冬青 王小宁

【关键词】 CYP2C19；SNP；单倍型；药物代谢；个性化药物设计
基因组多态性是导致药物反应多态性的重要因素。人类群体中大约存在1 000万个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点，相邻SNPs的等位位点倾向以整体形式遗传给后代。位于染色体某一区域的一组相关联的SNPs等位位点被称作单倍型（haplotype），大多数染色体区域只有少数几个常见的单倍型（频率&>5%），但它们代表了群体中大部分的多态性，可见单倍型更能描述人类常见的遗传多态模式。在很多情况下，研究焦点已经从效应SNPs（causative SNPs）转移到效应单倍型（causative haplotype）［1］。2002年，国际科技界启动了“国际人类基因组单倍型图计划”，即HapMap计划，以期标出人类染色体上的单倍型及这些单倍型的标签SNPs［2］。目前HapMap计划已取得了重大进展，2007年10月公布了包含超过310万个SNPs的第二代人类基因组单倍型图谱［3］，这为研究人类疾病以及研究人类对药物和环境的反应等提供了重要的生物信息。
　　CYP2C19是一种十分重要的药物代谢酶，主要存在于肝脏微粒体内，许多内源性底物、环境污染物以及临床上大约2%的药物都由其催化代谢。研究发现，CYP2C19基因多态性可影响到许多重要临床应用药物的代谢，如omeprazole、diazepam、imipramine、propranolol等，是引起个体间和种族间对同一药物表现出不同代谢能力的原因之一［4，5］。CYP2C19基因的许多功能多态位点已被鉴定，如具有等位基因CYP2C19*2［6］和CYP2C19*3［7］的CYP2C19酶对药物底物的代谢强度弱，但这2个等位基因并不能解释所有的弱代谢，在不同的群体中可解释的弱代谢比例从小于50%到大于90%［8］，推测其表型与更多的功能多态位点相关。鉴于CYP2C19的重要性，本课题组利用相关文献资料、HapMap数据库生物信息资源以及本课题研究进展，分析总结了CYP2C19基因型、单倍性与药物代谢的相关性，为进一步利用单倍型进行个性化药物设计提供理论基础。
　　1 CYP2C19基因SNP与药物代谢
　　人CYP2C19基因位于10号染色体上，长约90.21 kb，含9个外显子和8个内含子。其mRNA序列、蛋白质序列和Contig参考序列在NCBI数据库中的登陆号分别为NM_000769.1、NP_000760.1和NT_030059.12。目前NCBI dbSNP数据库收录了该基因相关的SNP共318个，包括编码区SNP（cSNP）21个，分别位于mRNA序列的1、55、99、221、276、358、365、390、431、502、636、680、681、903、990、991、1059、1228、1251、1316和1440位，其中没有引起氨基酸改变的有8个，分别为99、390、681、903、990、1059、1251和1440位；而文献已报道与酶活性、药物代谢相关的效应cSNP有：1（A→G，Met ［M］→Val ［V］）、358（T→C，Trp ［W］→Arg ［R］）、395（G→A，Arg ［R］→Gln ［Q］）、431（G→A，Arg ［R］→His ［H］）、636（G→A，Trp ［W］→［Ter［*］］）、680（C→T，Pro ［P］→Leu ［L］）、681（G→A，mRNA剪切缺陷）、1297（C→T，Arg ［R］→Trp ［W］）和1473（A→C，［Ter［*］］→Cys ［C］），这些效应cSNP对应的CYP2C19等位基因分别为：CYP2C19*4［9］、CYP2C19*8［10］、CYP2C19*6［11］、CYP2C19*9［12］、CYP2C19*3［7］、CYP2C19*10［12］、CYP2C19*2［6］、CYP2C19*5［13］和CYP2C19*12［12］。
其中，CYP2C19*2突变会引起高加索人和日本人群抗痉挛药物（mephenytoin和Smephenytoin）的弱代谢［6，11］。CYP2C19*3可部分解释日本人群抗痉挛药物的弱代谢，联合 CYP2C19*2可100%解释该人群抗痉挛药物的弱代谢，即日本人群抗痉挛药物的弱代谢是由这两种突变引起的［7］。CYP2C19*4等位基因主要在高加索人群中被发现，也是抗痉挛药物弱代谢的等位基因之一，可解释高加索人群3%的弱代谢［9］。CYP2C19*5是罕见的突变基因，在高加索人群和中国白族人群中被发现，发生频率非常低（白族人0.25%，高加索人低于0.9%），但也可以引起弱代谢［13］。CYP2C19*6同样可以解释高加索人群部分的弱代谢，其对应的突变重组蛋白对Smephenytoin的催化活性几乎为0［11］。相对野生型重组蛋白，CYP2C19*8对应的突变重组蛋白对Smephenytoin和tolbutamide的代谢能力分别降低了90%和70%［10］。此外，以白种人、亚洲人和黑人的DNA为材料，测序发现了CYP2C19*9、CYP2C19*10和CYP2C19*12等多种等位基因［12］，而这3种等位基因只在黑人及其后代中出现，其中CYP2C19*9、CYP2C19*10突变重组蛋白对mephenytoin代谢水平分别有中等程度降低和显著性降低，而CYP2C19*12突变重组蛋白则不稳定。
　　CYP2C19除了野生型（wildtype，WT）等位基因CYP2C19*1外，存在CYP2C19*2～CYP2C19*21等多种突变等位基因，这些突变基本都是由cDNA上的SNP引起的，信息详见人类CYP等位基因命名委员会网站（http://www.cypalleles.ki.se/cyp2c19.htm）。其中，CYP2C19*2和CYP2C19*3为CYP2C19基因的主要突变体，其他在人类中较为罕见。除了效应cSNP对应的等位基因外，CYP2C19*7源于第5内含子的5′2供体剪接位点发生了单碱基突变T→A，造成剪接缺失［10］；CYP2C19*17有5′侧翼区-806C→T和-3402C→T 2个突变位点 ［14，15］，其中-806C→T起效应作用，因为含-806C→T的调控元件可结合肝核蛋白，可加快CYP2C19的转录速率，从而提高CYP2C19对omeprazole和mephenytoin的代谢效率。CYP2C19*17纯合子个体对escitalopram或omeprazole代谢快［16］，且CYP2C19*17和CYP2C19*1纯合子个体之间omeprazole和omeprazole sulphone的药物代谢动力学差异极显著，CYP2C19*17可能成为个性化用药的靶点［17］。在乳癌临床试验中，携带CYP2C19*17突变的患者可能受益于tamoxifen的辅佐治疗［18］。对HIV病人的临床试验显示，携带*1/*2 或*2/*2基因型的患者相对*1/*1基因型的患者来说，对nelfinavir（HIV蛋白酶的抑制剂）的代谢效率降低了50%［19］。另有研究还显示，对CYP2C9*2 和/或 CYP2C9*3携带者可适当降低 acenocoumarol的剂量［20］。
　　2 CYP2C19单倍型与药物代谢
　　HapMap计划（http://www.hapmap.org/）利用CYP2C19基因已发现的318个SNP中的49个构建单倍型，其中有5个cSNP，分别为rs4986893、rs6413438、rs4244285、rs3758580和rs3758581，对应在mRNA序列上的位置分别为636、680、681、990和991。这49个SNPs在不同的群体中出现的情况不完全相同，在非洲尼日利亚伊巴丹市的约鲁巴人三体家系（YRI）、具有北欧和西欧血统的犹他州人三体家系（CEU）、无血缘关系的汉族中国人群（CHB）+无血缘关系的日本人群（JPT）中分别出现31、33、36个。HapMap构建的CYP2C19单倍型复杂且种类繁多，难以直接与药物代谢能力联系起来。对其中的5个cSNP（636、680、681、990和991）采用PHASE软件［21］构建单倍型（表1），并根据3个效应SNP（636、680和681）推测单倍型组合与药物代谢的相关性。由表1可见，H1、h3和H3是最常见的单倍型，在YRI、CEU、CHB、JPT群体中均占比95%以上；在3个效应SNP中，680位点在4类群体中均无多态，636位点只在JPT群体中出现多态且636A基因频率低至2%，因此这些群体个体的药物代谢能力基本可根据681位点基因型作初步推导。
　　Nakamoto等［8］采用了由85个个体组成的欧美群体对CYP2C19基因的16个cSNP进行基因分型并构建单倍型（表2）。如果将表1的单倍型与表2的单倍型对应起来，则H1对应haplotype 1、h3对应haplotype 3、H3对应haplotype 2；如果将表2中636、680、681、990和991位点单独构建单倍型，则只出现表1中的H1、h3和H3单倍型，在这个欧美群体中的频率分别为：0.735（H1，0.723+0.012）、0.195（h3，0.122+0.047+0.026）、0.059（H3），虽然结果与CEU群体的有差异，但差异不显著。
　　从表1、表2可以看出，681和990位点是完全连锁的（681G990C或681A990T）。Nakamoto等［8］研究发现，纯合子681GG990CC单倍型组合（基因型）个体的药物代谢能力较强，杂合子681GA990CT单倍型组合个体的药物代谢能力中等，纯合子681AA990TT单倍型组合个体的药物代谢能力较弱；起效应作用的位点为681。此外，1位点（CYP2C19*4）为纯合突变GG的单倍型组合个体的药物代谢能力也较弱。 表1 HapMap中CYP2C19基因5个cSNP构建的单倍型及频率注：与haplotype1比较，出现不同碱基的位点用阴影表示
　　3 CYP2C19基因与个性化药物设计初探
　　CYP2C19酶活性存在显著的个体差异及种族差异，其不确定性严重影响了临床疗效和用药安全，而遗传多态性是产生这种差异的重要原因。为了将SNP或单倍型应用到个性化药物设计中，本课题组利用CYP2C9的晶体结构作为模板，成功模拟出CYP2C19的三维结构，预测了CYP2C19基因的活性位点，并将4种市售药物分子对接到活性位点上，找到了与药物分子相互作用较为重要的氨基酸［22］；进一步研究CYP2C19的2个cSNP（358T→C和991G→A；358为效应SNP，对应CYP2C19*8）对上述4种市售药物分子的影响，结果发现，358T→C改变了其中2种药物分子与CYP2C19的结合能，而991G→A对4种药物与CYP2C19的结合能几乎没有影响［23］。
　　许多研究表明，两个不相关个体的基因组序列仅有0.1%的差异，但这些差异造成了群体遗传相关特征差异，也造成了不同个体罹患疾病的不同风险和对药物的不同反应，而一种表型的产生可能由多个效应SNPs引起，这样就需要将这些效应SNP整合组成单倍型，即效应单倍型。CYP2C19基因已报道的效应SNP有：cSNP（1、358、395、431、636、680、681、1297和1473）、调控区-806C→T和第5内含子的5′2供体剪接位点T→A，如果将这些位点组合起来构建单倍型，将会为个性化药物设计和个性化用药提供更全面的信息。Nakamoto等［8］选择了多个效应SNP构建单倍型，其结果对应用具有一定的指导意义。在不同群体中全面分析CYP2C19 效应SNP组成的单倍型，并将单倍型作为CYP2C19蛋白质结构预测和分子对接的基础来设计药物，将会使药物设计或实施个性化用药更加合理。

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