RNAi沉默survivin基因对胰腺癌细胞增殖、凋亡和周期的影响

　　　　　　 作者：田维军 赵金伟 宋晓斌

【摘要】 目的 应用RNAi技术沉默胰腺癌细胞株中survivin基因对肿瘤细胞凋亡、细胞周期和增殖的变化。方法 靶向survivin的RNAi载体转染胰腺癌细胞，Western印迹检测基因沉默效果，MTT法和流式细胞术检测细胞增殖、凋亡及细胞周期。结果 survivin基因沉默效率可达85%；MTT检测显示，干扰组survivin沉默细胞增殖抑制与非特异性质粒对照组相比显著增高（P<0.01）。流式细胞术显示，干扰组细胞凋亡百分率显著高于非特异性质粒对照组（P<0.01）；G2/M期显著高于非特异性质粒对照组（P<0.01或P<0.05），而S期则显著降低（P<0.05）。结论 survivin基因沉默可引起胰腺癌细胞周期阻滞，促进细胞凋亡，抑制细胞增殖。

【关键词】 RNAi；survivin；细胞凋亡；细胞周期；胰腺癌

胰腺癌的发生、发展以及侵袭、转移是多基因参与、多步骤发生的过程，其中生存素（survivin）是一类在胰腺癌的发生、发展中起非常重要作用的癌基因〔1〕，其参与细胞多种重要生物学过程，包括基因转录调控、胚胎发生、细胞分化、肿瘤形成和转移等〔1，2〕。survivin在胚胎期表达丰富，而在成熟组织中则表达极少或缺失，但在病理情况下，包括胰腺癌的很多恶性肿瘤组织中均发现有survivin的高水平表达，并且其表达量与肿瘤恶性程度及转移能力呈正相关〔1，3〕。survivin的过表达和激活不仅与预后不良密切相关，而且能影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，是胰腺癌基因治疗的潜在靶点之一〔4，5〕。本研究选择survivin分子作为干扰靶点，检测沉默该基因后对胰腺癌细胞凋亡和细胞周期的影响，为进一步研究survivin基因在肿瘤细胞生物学特性及免疫抑制中的作用构建技术平台。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂

　　人胰腺癌细胞株PC3购自中国科学院上海生物研究所细胞库，以含10%胎牛血清（Hyclone公司）的DMEM（Gibco公司）培养基，37℃，5%CO2孵箱（SANYO）培养。转染试剂LipofectamineTM 2000（美国Gibco公司），ECL化学发光试剂盒（美国Pierce公司），小鼠抗人单克隆survivin抗体（Santa Cruz公司）。干扰质粒pGenesil2、非特异性siRNA（武汉市晶赛生物工程技术有限公司），pGensilsiRNAsurvivin质粒由本室构建。AnnexinV凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。

　　1.2 细胞培养与细胞转染

　　转染前1 d将对数生长期的胰腺癌细胞株PC3以2×105个/孔接种于6孔培养板，细胞铺板在2 ml含血清、不含抗生素的DMEM培养基中，24 h内、细胞融合达40%～60%时进行转染，将siRNA LipofectamineTM2000复合体加到培养板中（转染方法按试剂盒说明书操作），转染体系为500 μl，siRNAs终浓度为100 nmol/L。

　　1.3 Western印迹检测基因沉默效果

　　收集细胞，用PBS缓冲液漂洗3次，加入200 μl 细胞裂解液混匀、冰浴30 min。15 000 r/min离心10 min，以Lowry′s 法行总蛋白定量分析。制备12％分离胶、5％积层胶，上样，在8 V/era电压条件下行SDS聚丙烯酰胺电泳，待溴酚蓝进入分离胶时，将电压提高到15 V/era。电泳结束后，将分离出的蛋白质转至硝酸纤维素膜上（Millipore，USA），5％脱脂奶粉的TBS溶液封闭2 h，鼠抗人单克隆一抗和βactin室温孵育2 h，二抗室温孵育1.5 h，ECL 试剂盒显色，拍照，比较各组灰度变化。分为siRNA干扰组、siRNA干扰对照组(用非特异siRNA LipofectamineTM 2000复合体转染)、空载体组(以空白载体复合体转染)、未转染对照组(以等量培养基处理)作为对照，观察各组干扰效果。

　　1.4 MTT法检测细胞增殖

　　将各组细胞以2 000个/孔的密度接种于96孔板，体积200 μl/孔。分别于转染后24、48、72 h进行MTT检测，酶标仪测定570 μm处OD值，连续测定3 d。每个时间点设5个复孔，根据吸光度值绘制曲线，比较各组细胞生长速度变化。分为siRNA干扰组和非特异性转染对照组。

　　1.5 流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡

　　分别于转染后24、48、72 h收集细胞，冷PBS洗涤2次，－20℃预冷的70%乙醇固定48 h，1 200 r/min离心10 min弃上清，1 000 μl PBS重悬加10 mg/ml RNase 20 μl混匀，37℃水浴45 min，PBS洗Rnase，100 μl PBS重悬，100 μl PI 4℃避光染色1 h。流式细胞仪测定荧光强度，CellQuest分析软件进行细胞周期DNA含量分析，确定细胞周期分布。细胞凋亡的检测采用Annexin V细胞凋亡检测试剂盒，实验操作按说明书进行。每组细胞重复3个样本，分为siRNA干扰组和非特异性转染对照组。

　　1.6 统计学分析

　　数据均以x±s表示，采用统计软件SPSS 16.0分析。

　　2 结 果

　　2.1 Western印迹检测siRNA抑制survivin基因的效果

　　空载体组及siRNA干扰对照组survivin表达未受抑制，与未转染对照组比较无显著差异；而干扰组survivin表达与对照组相比则明显受到抑制，干扰效率达到85%以上，说明RNAi载体构建有效，能够有效地抑制转染细胞中survivin的表达(图1)。

　　2.2 survivin基因沉默对PC3细胞增殖的影响

　　MTT检测结果显示，PC3细胞行survivin基因干扰后0～72 h，较相同时间点对照组细胞吸光度A值降低；其中24、48 h干扰组PC3细胞吸光度A值明显低于对照组（P<0.05）。对照组PC3细胞24～72 h增殖抑制率分别为6.7%、11.6%和5.3%；干扰组PC3细胞24～72 h增殖抑制率分别为30.9%、29.8%和19.1%，对应时程组间增殖抑制率比较有显著差异（P<0.05）（图2）。

　　2.3 survivin基因沉默对PC3细胞凋亡和细胞周期的影响

　　流式细胞术结果显示，与对照组比较，各时点干扰组细胞在G1期前均出现显著的凋亡现象，以48 h最为显著，24、48、72 h凋亡细胞百分率分别为（33.67±4.24）%、（42.12±5.88）%、（38.37±7.91）%，与同时点对照组〔(2.01±0.42）%、（3.13±0.69）%、（3.74±0.9）%〕比较均具有显著性差异（P<0.01)，提示特异性siRNA沉默survivin基因后的PC3细胞发生了显著的凋亡现象（图3）。与转染非特异性干扰质粒组比较，各个时点转染特异性干扰质粒组的G2/M细胞百分率均显著增大（P<0.05），以48 h最为显著（P<0.01），而S期细胞百分率明显降低，与对照组比较有明显差异（P<0.05），两组G0/G1期及细胞周期流式细胞术检测结果细胞百分率无显著差异，提示survivin基因沉默后胰腺癌PC3细胞阻滞于G2/M期（图4）。

　　3 讨 论

　　survivin是用EPR1的cDNA在人类基因组文库中杂交、筛选出的凋亡抑制蛋白（IAP）家族新成员〔1，6〕。survivin蛋白半衰期为30 min，其表达具有明显的周期依赖性。在G0／G1期检测不到survivin蛋白表达，S期表达量升高，G2／M期可升高40倍〔7〕。survivin表达也具有明显的组织选择性，生理状态下，在正常成熟组织中检测不到survivin表达，但其显著高表达于14～21周龄的胚胎组织中，因此推测survivin可能与组织器官的发育、成熟密切相关〔8〕。有研究证实，胸腺中survivin蛋白的高表达对于T细胞的分化、成熟有着重要意义。由于survivin蛋白在诸多肿瘤组织中（如肝癌、乳腺癌、白血病等）高表达，因此有人将survivin蛋白称作是肿瘤的通用抗原。由于survivin具有抑制凋亡、调控细胞周期、影响有丝分裂过程、促进血管生成等生物学作用，其高表达必然会对肿瘤细胞的生长与增殖产生影响——肿瘤细胞凋亡耐受、肿瘤血管的生成及向周围组织浸润能力的增强，并且随着survivin蛋白表达的增加，肿瘤细胞也表现一定的辐射耐受性及化学药物耐受性〔9，10〕。因此，survivin成为具有潜在价值的胰腺癌治疗的新靶点，沉默该基因可能对胰腺癌细胞生物学行为产生重要影响。

　　本研究MTT结果显示，survivin基因沉默后肿瘤细胞生长速度显著低于对照组细胞，说明survivin基因抑制直接导致了肿瘤增殖的抑制；流式细胞术结果显示，G2/M期细胞百分率显著高于对照组，S期细胞百分率显著低于对照组，说明survivin基因的沉默导致了细胞周期的阻滞，也进一步提示survivin可能参与胰腺癌细胞的周期调控；流式细胞术结果显示，G1期前有凋亡峰存在，且凋亡细胞百分数显著高于对照组，说明survivin基因沉默促进了胰腺癌细胞的凋亡，同时也提示survivin可能与胰腺癌细胞的凋亡密切相关。

参考文献

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