非酒精性脂肪性肝病的血清蛋白质指纹图谱的临床研究

【摘要】 分析非酒精性脂肪性肝病患者血清蛋白质指纹图谱，探讨非酒精性脂肪性肝病患者蛋白表达的差异性。［方法］应用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱（SELDITOFMS）及弱阳离子交换蛋白质芯片（weak cationic exchanger protein chip）技术检测29例非酒精性脂肪性肝病患者和16例正常健康人血清，获得血清蛋白质指纹图谱。［结果］在非酒精性脂肪性肝病患者与正常对照组之间检测到14种差异蛋白（P<0.05）。［结论］非酒精性脂肪性肝病与正常健康人之间存在一些差异表达蛋白质。

【关键词】 脂肪性肝病；非酒精性；蛋白质指纹图谱

　　　　非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种病变在肝小叶以肝细胞脂肪变性和脂肪贮积为病理特征但无过量饮酒史的临床综合征，主要包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎（NASH）、脂肪性肝纤维化和肝硬化。本文应用SELDITOFMS及蛋白质芯片技术从血清蛋白质指纹图谱角度探讨其在NAFLD患者中的变化及意义。

　　1 临床资料

　　29例为2008年1月至2008年8月浙江省人民医院体检人员，符合中华医学会肝病学分会脂肪肝与酒精性肝病学组2006年2月修订《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》中规定诊断标准［1］。其中男27例，女2例；年龄27～68岁，平均47.5岁；血清谷丙转氨酶升高7例，γ-谷氨酰转肽酶升高5例，（血清谷丙转氨酶和γ-谷氨酰转肽酶均升高2例），血脂异常者17例，空腹血糖升高者5例。选择16例正常健康人为对照组，其中男15例，女1例；年龄28～65岁，平均46.5岁。2组年龄、性别等资料经统计学处理无显著性差异，具有可比性。

　　2 材料与方法

　　（1）材料：尿素、乙腈、三氟乙酸、TrisHCl pH9.0、CHAPS、DTT、NaAc、HPLC h3O和sinapinic acid（SPA）等均购自Sigma公司。（2）方法：①血清标本处理：在29例NAFLD患者和16例正常健康人中各空腹采集静脉血3ml，采集后立即于4℃低温冰箱静置2h，4℃，4000r/min离心10min分离血清，将血清于4℃，12000r/min再次离心5min，去除所有残留细胞碎片和不溶物，在冰上将血清分装为每管100μl，保存于-80℃冰箱。实验检测血清均仅一次冻融。从-80℃冰箱中取出血清样品，于4℃，10000 r/min，离心5min；取血清10μl，加入20μlU9缓冲液（9M Urea，2%CHAPS，50mM TrisHCl，pH9.0）稀释，而后，将以上标本冰浴振荡30min，400r/min；将30μl上述变性后标本加入360μl相应的结合缓冲液混匀，待用。所有样本均进行双份检测以减少实验误差。②WCX2操作简要步骤：将200μl结合缓冲液（50mM NaAc，Ph4.0）加至已装好WCX2的Bioprocessor（美国Ciphergen公司）中，置振荡器（MS1 Minishaker）400～600r/min震荡5min，甩掉缓冲液。重复上述操作2次。在芯片处理器每孔中加入100μl处理好的标本，置振荡器400～600r/min，4℃震荡1h；甩出标本。每孔加入200μl结合缓冲液，室温置振荡器400～600r/min，震荡5min，甩去孔中液体，再次加入结合缓冲液200μl，重复操作一次。立刻拆开芯片处理器，取出芯片，待干后，在每个加样孔上加SPA0.5μl，干燥后再重复加SPA0.5μl一次，然后用蛋白质指纹图谱仪（SELDITOFMS，美国Ciphergen公司）阅读芯片。③蛋白质指纹图谱的测定参数和标化：在读取数据前，用加有allinone标准蛋白质的NP20芯片校正质谱仪，使分子误差<0.1%。本研究中阅读仪的主要参数设定：最佳激光强度240，最佳检测灵敏度8；设最高检测分子质量为50Da，最佳状态从1Da到15000Da；蛋白质指纹图谱的标化参数：蛋白峰范围质荷比（m/z）2000～45000；m/z为6634.8的蛋白为所有蛋白谱的共有蛋白，作为校正的内参照。
郎笑梅，等: 非酒精性脂肪性肝病的血清蛋白质指纹图谱的临床研究

　　3 统计学处理

　　蛋白质指纹图谱统计用Ciphergen Protein Chip软件，数据输入计算机，两样本总体方差齐同时，两样本均数用t检验；两样本总体方差不齐同时，两样本均数用近似t检验。

　　4 结果

　　29例NAFLD患者与16例正常对照组血清蛋白质指纹图谱建立后，在（m/z）2000～45000Da范围内，共检测出14种有差异蛋白（P<0.05），m/z为3401、4477、7976、8943、13749、15929、16098和23385的8种血清多肽蛋白在NAFLD患者中的浓度显著增高，而m/z为2190、2958、3163、5911、6116和33331的6种血清多肽蛋白在NAFLD患者中的浓度显著降低。特别是2958、3163、5911和6116的4种多肽蛋白浓度较正常对照组降低一倍多；而4477、7976和8943的3种多肽蛋白浓度较正常对照组极显著增高。差异极显著的多肽蛋白质结果见表1。表1 非酒精性脂肪性肝病的差异蛋白与正常组比较（略）差异极显著的多肽蛋白质指纹图谱见图1。

　　5 讨论

　　本文应用SELDITOFMS及蛋白质芯片技术，随机选择29例NAFLD患者和16例正常健康人为对照组进行血清蛋白质指纹图谱检测，两组间共检测出14种有差异蛋白（P<0.05），说明NAFLD患者与正常健康人血清蛋白质指纹图谱存在差异，NAFLD患者中8种血清多肽蛋白浓度显著增高，6种血清多肽蛋白浓度显著降低。特别是m/z为2958、3163、5911和6116的4种血清多肽蛋白浓度。有报道［23］8943的蛋白在肝硬化和肝癌中高表达，且在肝癌中浓度明显高于肝硬化患者；而4477的蛋白仅在肝癌患者中高表达。在NAFLD患者中4477和8943的多肽蛋白浓度增高，势必提示在NAFLD患者中早已潜伏着向肝硬化和肝癌转化的病理基础，此点有进一步论证的意义。另一方面，m/z为5911血清多肽蛋白浓度显著下降，也可能提示此多肽蛋白为NAFLD标志性蛋白，在NAFLD的发病机制中起主要作用。国外已建立血清蛋白质指纹图谱数据库［4］，可根据质荷比查找对应的蛋白质，从而为分析疾病发病机制提供依据。本研究下一步将选取差异显著的14个质荷比点进行数据库搜索，查找对应的蛋白质，分析非酒精性脂肪性肝病发病机制。

参考文献

1］中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组.非酒精性脂肪性肝病诊疗指南［J］.中华肝脏病杂志，2006，14（3）：161162.

　　［2］李悦国，张维铭.蛋白质组学在肝癌及其相关疾病研究中的应用［J］.中国肿瘤临床，2005，32：957960.

　　［3］刘池波.血清蛋白质谱模型在肝硬化诊断中的应用［J］.中华检验医学杂志，2006，29（6）：529530.

　　［4］李悦国，耿鑫，朱国平，等.肝癌病人血清蛋白质指纹图谱检测及其临床意义［J］.中华肝胆外科杂志，2007，13（10）：663666.