中国被毛孢发酵物对小鼠T、B淋巴细胞转化功能的影响

【摘要】 ［目的］ 观察中国被毛孢发酵物对正常小鼠T、B淋巴细胞转化功能的影响。［方法］给予小鼠高（1.0g·kg-1）、低（0.1g·kg-1）剂量的中国被毛孢发酵物，观察其对小鼠T、B淋巴细胞转化功能的影响。［结果］中国被毛孢发酵物和冬虫夏草均能显著提高正常小鼠脾T和B淋巴细胞转化刺激指数（P<0.05，P<0.01）；［结论］ 中国被毛孢发酵物和冬虫夏草均均能提高正常小鼠免疫功能。

【关键词】 中国被毛孢发酵物；T淋巴细胞；B淋巴细胞

　　Abstract： ［Objective］ To observe the proliferation of T and B Lymphocyte in mouse after treated by Hirsutella sinensis strain fermentation.［Methods］ Mice were treated with 1.0g·kg-1，0.1g·kg-1 of Hirsutella sinensis strain fermentation by intragastric administration.The proliferation of T and B Lymphocyte from the spleen of mouse is detected by the MTT assay .［Results］ Hirsutella sinensis strain fermentation and Cordyceps Sinensis can distinctly increasse the stimulation index （SI） of T and B lymphocyte transformation.［Conclusion］ Hirsutella sinensis strain fermentation and Cordyceps Sinensis are able to enhance immune function of normal mouse.

　　Key words：Hirsutella sinensis Strain Fermentation; T lymphocyte; B lymphocyte

　　中国被毛孢是从青海新鲜冬虫夏草分离的冬虫夏草菌种，通过人工液体发酵并冻干得到中国被毛孢发酵物。90年代通过分子生物学方法鉴定，多次证明中国被毛孢为冬虫夏草无性型［13］。由于该菌种分离与培养都较其他真菌困难，中国被毛孢发酵物药理研究报道甚少，本实验初步观察了中国被毛孢发酵物对正常小鼠免疫系统的影响。

　　1 材料

　　1.1 药物和试剂

　　中国被毛孢发酵物：黄色粉末，由杭州泰士生物科技有限公司提供，给药前药物高、低剂量组用蒸馏水分别配制成100mg·ml-1、10mg·ml-1的混悬液；冬虫夏草：杭州泰士生物科技有限公司提供，由青海省畜牧兽医科学院沈南英教授鉴定，临用前将冬虫夏草60℃烘干，打粉，药物高、低剂量组用蒸馏水分别配制成100mg·ml-1、10mg·ml-1的混悬液；刀豆素（ConA）：sigma公司，批号：11028710；脂多糖（LPS）：sigma公司，批号：024K4067；RPMI1640培养液：GIBCO公司，批号：1165062；噻唑蓝（MTT）溶液：sigma公司，批号：3154B79。

　　1.2 动物

　　18～20g SPF级ICR小鼠，来源：中科院上海实验动物试验中心/上海斯莱克实验动物公司，生产许可证：SCXK（沪）20070006。

　　1.3 仪器设备

　　128C340型酶标仪：奥地利CliniBio公司；CB150型CO2培养箱：德国Binder公司； DL5B型离心机：上海安亭科学仪器厂制造；ZEISS AXIOVERT 200倒置显微镜：德国ZEISS公司。

　　2 方法

　　2.1 分组

　　取18～20g的雄性ICR小鼠50只，按体重随机分5成组：空白对照组、中国被毛孢发酵物高剂量组1.0g·kg-1、中国被毛孢发酵物低剂量组0.1g·kg-1、冬虫夏草高剂量组1.0g·kg-1及冬虫夏草低剂量组0.1g·kg-1，每组10只。

　　2.2 给药方法

　　除空白对照组灌蒸馏水外，其余组每d灌胃给药1次，连续7d。

　　2.3 小鼠脾淋巴细胞悬浮液的制备［45］

　　末次给药后30min，小鼠摘眼球放血致死，75%乙醇浸泡5min，无菌取脾，用1ml注射器塞磨碎，尼龙绸布过滤到10ml离心管中，用Hank’s液洗涤，合并洗涤液，1500rpm离心5min，弃上清，加Hank’s液至7ml，细胞混匀，再离心，重复2次。进行细胞计数，以RPMI 1640完全培养液稀释至1×107 个/ml的脾细胞混悬液备用。

　　2.4 MTT法淋巴细胞增殖反应实验［45］

　　新鲜分离的1×107cell/ml小鼠脾细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔加100μl脾细胞混悬液，再根据实验设计加入刺激剂（ConA和LPS）50μl／孔，每个样品设3个平行孔并设对照孔（仅加RPMI 1640培养基），将培养板置于37℃的5%CO2培养箱中培养44h。每孔加入50μl MTT溶液（2mg/ml），继续培养4h。培养物1500rpm离心5min，弃去上清，每孔加150μl 酸性DMSO溶液，振荡，使紫色结晶完成溶解（置暗处室温放置15～30min）。以酶标仪于578nm处测其OD值。计算刺激指数（stimulation index，SI） =加ConA细胞孔的平均OD值÷对照孔的平均OD值。

　　2.5 统计学处理方法

　　试验结果以x±s表示，用SPSS10.0统计软件进行t检验。

　　3 结果

　　3.1 对正常小鼠T淋巴细胞转化率的影响

　　与空白对照组比较，中国被毛孢发酵物（1.0g·kg-1）和冬虫夏草（1.0g·kg-1）高剂量组均能非常显著地提高小鼠脾T淋巴细胞转化刺激指数（P<0.01）；同时，两者的低剂量也能显著提高小鼠脾T淋巴细胞转化刺激指数（P<0.05）（见表1）。表1 对小鼠脾T、B淋巴细胞转化刺激指数的影响（略）

　　3.2 对正常小鼠B淋巴细胞转化率的影响

　　结果可见，与空白对照组比较，中国被毛孢发酵物（1.0g·kg-1）和冬虫夏草（1.0g·kg-1）高剂量组均能显著提高小鼠脾B淋巴细胞转化刺激指数（P<0.05或<0.01），而两者低剂量组对小鼠脾B淋巴细胞转化无影响，见表1。

　　4 讨论

　　T、B淋巴细胞在体外培养时，受到有丝分裂原（如PHA、ConA）刺激后，可出现细胞体积增大，代谢旺盛，蛋白和核酸合成增加，即向淋巴母细胞转化和增殖。淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的细胞免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。本文研究结果表明中国被毛孢发酵物和冬虫夏草都能显著提高T、B淋巴细胞转化率，能提高正常小鼠免疫功能。冬虫夏草作为我国珍贵中药材之一，资源缺乏，冬虫夏草无性型中国被毛孢发酵物对冬虫夏草市场紧缺起到了一定的缓解作用，本次研究证明与天然冬虫夏草在增强免疫功能方面具有相似的功效，为中国被毛孢发酵物的临床应用提供了有价值的理论基础与实验依据。

参考文献

　［1］赵锦，王宁，陈月琴，等.冬虫夏草无性型的分子鉴别［J］.中山大学学报（自然科学版），1999，38（1）：121.

　　［2］王宁，陈月琴.虫草属多元起源的分子生物学证据［J］.中山大学学报（自然科学版），2000，39（14）：70.

　　［3］魏鑫丽，印象初，郭英兰，等.冬虫夏草及其相关类群的分子系统学分析［J］.菌物学报，2006，25（2）：192.

　　［4］陈奇.中药药理研究方法学［M］ .北京：人民卫生出版社，1993：667.

　　［5］李仪奎.中药药理实验方法学［M］ .上海：上海科学技术出版社，1991：329.