杜仲对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织MMP2表达的影响

【摘要】 ［目的］观察杜仲对单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠肾组织MMP2的影响并探讨其可能机制。［方法］采用单侧输尿管梗阻（UUO）肾间质纤维化模型。将32只大鼠随机分为4组，每组8只，即假手术组、模型组、厄贝沙坦组和杜仲组。厄贝沙坦组给予厄贝沙坦10 mg·kg-1·d-1、杜仲组给予杜仲6 g·kg-1·d-1治疗。术后2周处死大鼠，光镜下观察Masson和HE染色肾间质纤维化指数，观察肾组织病理改变，并应用免疫组织化学方法检测肾组织基质金属蛋白酶2（Matrix metal proteinase  2，MMP2）的表达。［结果］1.UUO组与假手术组相比，BUN，Scr水平均显著增加，杜仲组较UUO组呈下降趋势。厄贝沙坦组作用效果与杜仲组相似，且两组间比较，无显著差异（P>0.05）。2.与假手术组相比，肾组织行HE染色UUO组可见弥漫的肾小管上皮细胞空泡变性、扩张、部分萎缩，偶见坏死，肾间质增宽，大量的炎细胞浸润和间质纤维化，肾小球病理改变不明显，杜仲组上述改变均有所减轻，厄贝沙坦组病理改变与杜仲组相似，且两组间比较，无显著差异（P>0.05）。3.与假手术组相比，Masson染色结果显示UUO组可见肾间质增宽、有大量胶原纤维增生，肾小球病变不明显，杜仲组上述改变均有所减轻，厄贝沙坦组病理改变与杜仲组相似，且两组间比较，无显著差异（P>0.05）。4.MMP2在假手术组大鼠肾间质中呈棕黄色颗粒状表达，UUO组中大鼠肾间质仅有少量表达且着色稀疏，杜仲组MMP2表达较假手术组减轻，但其表达仍高于UUO组。厄贝沙坦组与杜仲组相似，且两组间比较，无显著差异（P>0.05）。［结论］杜仲可上调MMP2的表达，进而减缓肾纤维化的病程进展。

【关键词】 杜仲；肾间质纤维化；单侧输尿管梗阻；基质金属蛋白酶2

　　Abstract： ［Objective］ To investigate the effects of Eucommia on renal interstitial fibrosis and its mechanism.［Methods］Using renal interstitial fibrosis in rats with Unilateral Ureteral Obstruction（UUO）.Adult female SD rats（n=32） were randomly pided into 4 groups： Sham operation group （Sham）; UUO group，Irbesartan group; Eucommia group.Undergo light microscopy by Masson and HE staining to observe the renal interstitial fibrosis index.To detect the expression of MMP2 by immunohistochemistry 2w after surgery.［Results］ 1.The levels of BUN and Scr in UUO group were significantly higher than in Sham group.Compared with UUO group，the levels of BUN and Scr in irbesartan and eucommia groups were significantly lower.There was no significant difference between irbesartan group and eucommia group.2.The renal tissue was stained with HE.There was no change in Sham group.But in UUO group，there was tubular epithelial cells denaturalization，renal tubular expand or atrophy，interstitial macrophage and monocyt infiltration，interstitial expand，and there was no glomeruli change.While the change in irbesartan and eucommia group was slighter than that in UUO group.There was no significant difference between irbesartan group and eucommia group.3.The renal tissue Masson staining showed that there was interstitial expands fibrous tissues proliferation and there was no glomeruli change in UUO group.Compared with UUO group，the level of pathological change in irbesartan and eucommia groups was significantly lower.There was no significant difference between irbesartan group and eucommia group.4.The expression and distribution of MMP2 were strong in Sham group，while in other groups lower in renal interstitial.Compared with UUO group，the level in irbesartan and eucommia groups was significantly higher.There was no significant difference between irbesartan and eucommia groups.［Conclusion］ Eucommia inhibits the renal interstitial fibrosis lesion upregulating the MMP2 expression and blocking renal fibrosis.

　　Key words：eucommia; renal interstitial fibrosis; unilateral ureteral obstruction; MMP2

　　肾间质纤维化是所有肾脏病进行性发展的最终结果，是导致终末期肾病的主要病理基础。肾小管间质病变程度是决定10年肾脏存活率的最重要的影响因素，其影响程度较肾小球病变的严重程度更为重要［1］。本实验应用UUO模型，通过MMP2表达观察杜仲对肾间质纤维化的防治作用并探讨其可能机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物

　　清洁级SD雄性大鼠32只（武汉大学人民医院动物中心提供），体重200±20g。温度（23±2）℃，相对湿度为（55±2）%，定时日光灯照射12h/d，房间保持通风、恒温、安静，定期更换垫料，清洗笼具。

　　1.2 药物及试剂

　　MMP2抗体（兔抗鼠多克隆抗体，BA0569）；SP免疫组织化学试剂盒均购自武汉博士德（Boster）生物有限公司，显色底物为DAB（北京中山生物技术有限公司）;杜仲（免煎中药）由三九医药股份有限公司提供，批号0702014;厄贝沙坦由杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司提供，批号0601137。

　　1.3 模型的建立与分组

　　单侧输尿管结扎（UUO）诱导肾间质纤维化大鼠模型：10%水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉大鼠，取右侧卧位，背部左肋下备皮，常规消毒，选左侧背部肋下0.5cm为切口，打开腹腔，游离左肾及左侧输尿管，将左侧输尿管用组织钳托起，取中上段，用止血钳夹住，在两端用丝线结扎后剪断左侧输尿管，然后逐层缝合；假手术组打开腹腔后即缝合。随机分为4组：模型组、假手术组、厄贝沙坦组和杜仲组。每组各8只，组间大鼠体重无统计学差异。手术前2d开始给药，假手术组、模型组均给予等量生理盐水灌胃;厄贝沙坦组给予厄贝沙坦10 mg·kg-1·d-1，杜仲组给予杜仲6 g·kg-1·d-1灌胃。

　　1.4 观察指标及方法

　　1.4.1 常规指标测定（Scr BUN）

　　10%水合氯醛0.3ml/100g 腹腔注射麻醉大鼠，从颈总动脉采血，离心分离血清用于测定BUN、Scr；血尿素氮（Bun）采用脲酶—波氏比色法、血肌酐（Scr）采用苦味酸法，由武汉大学人民医院生化室测定。

　　1.4.2 肾组织病理光镜检查

　　取左侧肾组织，用10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，以3μm的石蜡切片行HE、Masson染色。双盲法观察肾皮质间质变化情况。肾小管间质损害程度按Mezzano方法进行半定量分级：0 级：正常; Ⅰ级：肾小管上皮细胞轻度萎缩、变性，坏死轻，呈灶性分布，少量散在炎性细胞浸润，纤维组织增生成小灶状、少量分布，病变范围< 25 %; Ⅱ级：肾小管上皮细胞中度萎缩、变性，坏死轻，炎性细胞浸润，纤维组织中度增生，病变范围25 %～50 %; Ⅲ级：肾小管上皮细胞萎缩、变性和坏死重，呈片状分布，大量弥漫或聚集成灶的炎性细胞浸润，纤维组织增生呈束状、多灶或网状成片，病变范围>50 %。观察连续不重叠的10 个高倍皮质视野，综合进行评定。光镜下观察肾脏组织皮质区肾小管及间质的结构及变化。切片在HPIAS1000 高清晰彩色病理图象分析软件上，每张切片随机选取5 个高倍视野，测定一定面积内阳性信号面积和阳性信号平均灰度值，阳性信号指数（PI）=阳性信号面积×阳性信号平均灰度/测定面积。

　　1.4.3 肾组织免疫组织化学（SP 法）

　　兔抗大鼠MMP-2多克隆抗体及SP法试剂盒购自武汉博士德生物公司，按SP法试剂盒说明进行操作。

　　1.4.4 统计学处理

　　以均数±标准差（x±s） 表示，用SPSS13.0 统计软件进行统计学分析，计数资料采用卡方检验，多组计量资料间比较采用单因素方差分析。

　　2 结果

　　2.1 肾功能检测

　　造模后UUO组大鼠血尿素氮及肌酐均明显升高，与假手术组相比，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。表1 各组大鼠Scr、BUN的变化（略)

　　2.2 肾组织HE和Masson染色光镜观察结果

　　光镜下假手术组肾小球及肾小管间质正常，模型组肾小管上皮细胞弥漫空泡变性，多数肾小管扩张、萎缩，间质多灶状单核细胞浸润和纤维化。杜仲组间质内炎细胞则呈小灶性浸润，少许上皮细胞肿胀，少部分肾小管轻度扩张，肾间质未见明显纤维化。Masson染色见假手术组肾脏的胶原染色主要位于肾小球基膜、Bowman 囊、系膜区和肾小管的毛细血管周围，而肾小管周围间质部分则比较狭窄；UUO 组可见肾间质大量胶原纤维增生，间质胶原纤维呈蓝色染色，间质纤维化呈灶状分布，肾小球病变不明显，偶见肾小球局灶性节段性硬化。

　　2.3 MMP2蛋白表达分布

　　MMP2主要位于皮质肾小管上皮细胞管腔侧细胞浆和细胞膜中，在肾小球和肾间质中仅有少量分布。UUO组MMP2表达较假手术组明显减弱且分布面积减少，厄贝沙坦组和杜仲组MMP2的表达较模型组显著增强且面积增加，二者无显著性差异。UUO组MMP2免疫组化PI值较假手术组明显下调（P<0.05），提示 MMP2 在 UUO 大鼠肾小管上皮中表达明显下降；杜仲组与厄贝沙坦组PI值均较UUO组增加（P<0.05）。提示杜仲和厄贝沙坦均可增强MMP2在UUO大鼠肾组织中蛋白表达；二者亦无显著性差异。见表2，图1。表2 各组大鼠MMP2的PI 值变化（略）

　　3 讨论

　　肾间质纤维化（Renal tubulointerstitial fibrosis）是各种原因所致的肾脏疾病慢性进展，最终导致肾功能衰竭的共同机制，其主要病理基础是细胞外基质（ExtracellularMatrix，ECM）代谢失衡，在间质异常积聚［2］。单侧输尿管梗阻动物模型是研究单纯性肾间质慢性炎症和肾间质纤维化的理想模型［3］。本实验免疫组化的结果显示：术后2周，UUO组MMP2表达较假手术组明显减弱且分布面积减少，厄贝沙坦组和杜仲组MMP2的表达较模型组显著增强且面积增加。UUO组MMP2免疫组化PI值较假手术组明显下调，提示 MMP2 在 UUO 大鼠肾小管上皮中表达明显下降。
　　
　　杜仲的主要功效成分有木脂素类、环烯醚萜类、苯丙素类、黄酮类、多糖类、杜仲扩真菌蛋白，此外杜仲还含有丰富的营养成分有氨基酸、脂肪酸、维生素、微量元素等［4］。杜仲具有调节血压、降低血糖、调节血脂、抗菌、抗病毒、抑制肿瘤细胞生长等药理作用，以及延缓衰老、美白养颜、滋阴补肾、强壮筋骨等功效。我国名贵的滋补中药材，在中药古典《神农本草经》、《本草纲目》中就被列为药之上品［5］。本实验发现杜仲能减轻肾间质纤维化，作用与厄贝沙坦相似，能增强MMP2在肾间质的表达。提示杜仲可能通过增强MMP2在 UUO 大鼠肾小管上皮表达的上调，从而延缓肾小管损伤及间质纤维化的进展。其机理可能如下，可能通过对MMP2表达的增强，上调ECM代谢的基质降解酶系统（MMPS/TIMPS系统和PA/PAI系统），在各种细胞因子、细胞等因素作用下使ECM降解［3］。

　　总之，杜仲抗肾纤维化的作用值得肯定。即可通过增强MMP2的活性，从而抑制纤维化的进展。
但是，其确切分子机制尚有待于进一步研究。

参考文献

　［1］Alexopoulos E，Papagianni A，Papadimitriou M.Is membranous nephropathy only a glomerular disease［J］.Rena Fail，1998，20（1） ：16.

　　［2］Beaudeux JL，Giral P，Bruckert E，et al.Matrix metalloproteinases，inflammation and atherosclerosis?：therapeutic perspectives［J］.Clin Chem Lab Med，2004，42：121131.

　　［3］Zeisberg M，Maeshima Y，Mosteman B，et al.Renal fibrosis：Extracellular matrix microenvironment regulates behavior of activated tubular epithelial［J］.Pathol，2002，160（6）： 20012008.

　　［4］Yokoi H，Mukoyama M，Sugawara A，et al.Role of connective tissue growth factor in febronectin exp ression and tubulointerstitid fibrosis［J］.Am J Physiol，2002，282（5）：933942.

　　［5］盛军利，孙桂菊.杜仲的功效学研究现状及其应用前景［J］.医学综述，2006，12（16）： 10221024.