作者：夏小萍，马正良，朱巍，周锦勇
【摘要】 目的 探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)在慢性收缩性损伤(CCI)所致神经病理性疼痛大鼠的L4背根神经节中的蛋白表达。方法 实验1：24只SD大鼠，随机分为正常组(Naive组)、假手术组(Sham组)和CCI组(每组n=8)。Naive组不做任何手术;Sham组仅暴露坐骨神经;CCI组按Bennett法结扎右侧坐骨神经主干制备CCI模型。分别测定Sham组和CCI组术前2天(基础值)及术后第1、3、5、7、14、21天(Naive组则在相对应的时间点)大鼠同侧(本实验为右侧)后足机械缩足反射阈值(MWT)和热缩足反射潜伏期(PWL)。实验2：18只SD大鼠随机分为正常组(Naive组)、假手术组(Sham组)和CCI组(每组n=6)。CCI组制备CCI模型，术后第7天处死大鼠，取同侧L4背根神经节;Naive组不做任何手术，直接取右侧L4背根神经节;Sham组仅暴露坐骨神经，术后第7天处死大鼠，直接取右侧L4背根神经节。采用Western blot法检测脊髓L4背根神经节GDNF的蛋白表达。结果 实验1：与Sham组相比，CCI组大鼠从术后第3天开始至术后21天内各时间点MWT和PWL均显著降低(P<0.05或P<0.01)。实验2：与Sham组相比，CCI组在L4背根神经节的GDNF表达明显减少(P<0.01)。结论 CCI大鼠的L4背根神经节的GDNF表达减少，可能参与CCI所致神经病理性疼痛的发病机制。
【关键词】 慢性收缩性损伤;神经病理性疼痛;胶质细胞源性神经营养因子;背根神经节;动物模型;大鼠
Abstract： Objective To investigate the expression of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) in the fourth lumbar (L4) dorsal root ganglion (DRG) in rats with neuropathic pain induced by chronic constrictive injury (CCI).Methods Experiment 1: 24 Sprague-Dawley rats were randomly designated as Naive group， Sham group and CCI group (n=8 each). The CCI model was established by loose ligation around the right L4 sciatic nerve as described by Bennett. In the Sham group only the right sciatic nerve was exposed and in the Naive group no treatment was performed. Mechanical withdrawal threshold (MWT) using Von Frey filament and paw withdrawal latency (PWL) using radiant heat applied to the right hind plantar surface were measured 2 days before surgery (baseline) and 1， 3， 5， 7， 14 and 21 days after operation (with the Naive group measured at the corresponding time points). Experiment 2: 18 Sprague-Dawley rats were pided into Naive， Sham and CCI groups (n=6 each). The animal model was established with the CCI group. The rats in CCI groups were decapitated on the 7th day after operation and the right L4 DRG was removed; in the Naive group the rats underwent no operation and the right L4 DRG was directly removed， and in the Sham group the right sciatic nerve was only exposed and the right L4 DRG was taken out. The expression of GDNF of spinal L4 DRG was determined by Western blot.Results In Experiment 1， MWT and PWL of rats in the CCI group were significantly lower than those in the Sham group from day 3 to day 21 (P<0.05 or P<0.01). In experiment 2， the expression of GDNF in the right L4 DRG significantly decreased as compared to that of the Sham group (P<0.01). Conclusion The downregulation of GDNF of the L4 DRG in rats was probably involved in the mechanism of CCI induced neuropathic pain.
Key words: chronic constrictive injury; neuropathic pain; glial cell line-derived neurotrophic factor; dorsal root ganglion; animal model; rats
胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor， GDNF)于1993年由Lin等[1]从大鼠神经胶质细胞系B49的培养液中首先纯化并命名，其受体包括GFRα1和Ret。研究表明，GDNF是最强的多巴胺能神经营养因子，对运动神经元和感觉神经元有强大的神经营养作用。本研究通过制备大鼠慢性收缩性损伤(chronic constrictive injury， CCI)所致的神经病理性疼痛模型，采用Western blot观察CCI大鼠GDNF在脊髓背根神经节中的蛋白表达，以探讨其可能的发病机制。
1 材料和方法
1.1 制备CCI动物模型 SD大鼠(体重250～300 g)在标准条件下(标准温度、湿度、12 h明暗周期，可自由摄食摄水)饲养，腹腔内注射戊巴比妥钠40 mg/kg后，按Bennett法[2]结扎坐骨神经主干制备CCI模型。暴露右侧坐骨神经，在该神经主干部位，用4-0铬制羊肠线松结扎4道，间隔1.0～2.0 mm，局部覆盖青霉素粉末后，用细丝线缝合肌肉及皮肤，术后大鼠置于安静、温暖、避强光环境喂养。
1.2 动物分组和观察指标
1.2.1 实验1 24只SD大鼠随机分为正常组(Naive组)、假手术组(Sham组)和CCI组(每组n=8)。Naive组不做任何手术;Sham组仅暴露坐骨神经;CCI组制备CCI模型。分别测定Sham组和CCI组术前2天(基础值)及术后第1、3、5、7、14、21天(Naive组则在相对应的时间点)大鼠同侧(本实验为右侧)后足机械缩足反射阈值(MWT，单位：g)和热缩足反射潜伏期(PWL，单位：s)。
1.2.2 实验2 18只SD大鼠，随机分为正常组(Naive组)、假手术组(Sham组)和CCI组(每组n=6)。Naive组不做任何手术，直接取右侧L4背根神经节;Sham组仅暴露坐骨神经，术后第7天处死大鼠取同侧L4背根神经节;CCI组制备CCI模型于术后第7天处死大鼠取同侧L4背根神经节，采用Western blot方法检测GDNF的蛋白表达。
1.3 Western blot 方法
1.3.1 胞膜蛋白的提取 样本先放入预冷的匀浆液，低温匀浆，4℃ 800 g离心15 min，取上清液，4℃ 105 g离心1 h。离心沉淀加入匀浆液，沉淀充分溶解后在4℃ 105 g离心1 h，上清即为胞膜蛋白。
1.3.2 电泳、条带分析 按Bradford 法测定样本蛋白浓度后，加入1/4体积的5倍样本缓冲液，95℃水浴变性5 min。取等量40 μg蛋白样本加至12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上恒压电泳，湿转法转移至硝酸纤维素膜。分别加入5%脱脂奶粉TBST配制的一抗(1∶200兔抗鼠GDNF， Santa Cruz公司)，在摇床平台上于室温孵育4 h，TBST 漂洗滤膜3次，每次10 min。再加入小牛抗兔二抗(1∶500， Santa Cruz公司)，于37℃平缓摇动温育1 h。采用增强化学发光法(ECL)检测信号。滤膜浸入含化学发光试剂A、B 的水溶液中激发荧光，拍摄并扫描照片。反应条带作半定量分析。
1.4 统计学处理 数据均以±s表示，所得数据经SPSS 13.0软件处理，组内比较用t检验，组间比较用单因素方差分析(ANOVA)，P<0.05认为差异有显著性。
2 结 果
2.1 各组大鼠MWT的变化 与术前基础值和Sham组比较，CCI组大鼠从术后第3天开始至术后21天内各时间点MWT均显著降低(P<0.05或P<0.01)。Naive组和Sham组术后各时间点MWT与术前基础值比较差异无显著性(P>0.05)。见表1。表1 各组大鼠后足MWT的变化与术前基础值和Sham组比较：*P<0.05，**P<0.01
2.2 各组大鼠后足PWL的变化 3组间PWL基础值比较差异无显著性(P>0.05)。与术前基础值和Sham组比较，CCI组大鼠从术后第3天开始至术后21天内各时间点PWL均显著降低(P<0.01)。Naive组和Sham组术后各时间点PWL与术前基础值比较差异无显著性(P>0.05)。见表2。
2.3 各组大鼠L4背根神经节GDNF蛋白表达 与Sham组比较，CCI组L4的背根神经节中GDNF蛋白表达明显减少(P<0.01)。见图1。表2 各组大鼠后足PWL的变化
3 讨 论
国际疼痛研究会将由于外周或中枢神经系统的直接损伤或功能紊乱引起的疼痛称为神经病理性疼痛[3]。由于神经病理性疼痛发病机制复杂、症状多样，目前临床上尚缺乏有效的治疗药物和方法。因此，研究其发病机制和寻找能够消除神经病理性疼痛的药物已成为近年研究的热点问题之一。
神经病理性疼痛发病的基本过程是伤害性刺激在外周初级感觉神经元换能，转变为电信号，经脊髓、脑干和丘脑的传递和调制，最后在大脑皮质产生痛觉[4]。脊髓背根神经节作为痛觉传入的第1级神经元在痛觉传导通路中起着极其重要的作用。临床上神经病理性疼痛患者常表现出痛觉超敏、触诱发痛及自发痛现象。外周神经损伤后粗大的A纤维迅速再生，很快长芽侵入脊髓后角Ⅱ层，与Ⅱ层中正常情况下仅与C纤维形成突触联系的神经元建立新的突触联系，结果导致上位神经元对非伤害刺激的异常反应，背根神经节兴奋性增高，出现异常的、反复的电活动。这是痛敏形成的神经解剖学及电生理学基础。背根神经节中主要含有两类神经元，即大神经元和中、小神经元。大神经元的轴突是有髓鞘的，传递躯体的本体感觉及触压觉;而中、小神经元的轴突则无髓鞘，传递躯体的痛温觉和内脏感觉。感受与传递伤害性刺激的是背根神经节中的中、小神经元的纤维即Aδ纤维和C纤维。
最近的研究发现Aδ纤维和C纤维的功能可被GDNF调控[5]。GDNF通过靶细胞的逆向轴突运输调节脊髓神经细胞的代谢及功能活动，特别对小神经元C纤维的中枢突具有营养支持作用，抑制其退变，使之保持正常的突触联系[6]。在本研究中CCI大鼠模型成功的第7天，L4 背根神经节的GDNF蛋白表达明显减少，这表明GDNF可能参与了CCI所致神经病理性疼痛的发病机制。我们推测由于背根神经节缺乏足够的神经营养支持，Aδ纤维和C纤维的功能受到影响，神经的内稳态被打破。已有学者应用共聚焦显微镜证实大鼠的GDNF可从背根神经节神经元顺行转运至脊髓背角浅层[7]，通过Lissaue束外侧份的细纤维能与脊髓背角的神经元形成突触联系而传导痛温觉完成痛觉低级中枢的调控。由此看来，如果外源性补充GDNF可缓解神经的退变，也许不失为一种新型的治疗神经病理性疼痛的方法。
参考文献
[1] Lin LF， Doherty DH， Lile JD， et al. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons [J]. Science， 1993， 260(5111): 1130-1132.
[2] Bennett GJ， Xie YK. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man [J]. Pain， 1988， 33(1):87-107.
[3] 赵志奇.脊髓-痛觉整合的重要中枢[M]//赵志奇.疼痛及其脊髓机理. 上海：上海科技教育出版社，2000: 83-144.
[4] Bridges D， Thompson SW， Rice1 AS. Mechanisms of neuropathic pain [J]. Br J Anaesth， 2001， 87(1):12-26.
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[7] Charbel Issa P， Lever IJ， Michael GJ， et al. Intrathecally delivered glial cell line-derived neurotrophic factor produces electrically evoked release of somatostatin in the dorsal horn of the spinal cord [J]. J Neurochem， 2001， 78(2):221-229.