作者：纵雪梅 ， 许铁， 曾因明，裴冬生
【摘要】 目的 研究培高利特(pergolide)对沙土鼠前脑脑缺血/再灌注(I/R)损伤海马CA1区神经元低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1 α， HIF-1 α)表达的影响。方法 采用沙土鼠5 min I/R损伤模型。54只雄性沙土鼠随机分为3组：假手术组、I/R组、培高利特组。分别于再灌注第1、3、7天行免疫组织化学染色法，检测海马CA1区神经元HIF-1 α的表达。结果 假手术组沙土鼠海马CA1区HIF-1 α有较弱的表达。与假手术组相比，I/R组海马CA1区再灌注1天HIF-1 α的表达无明显改变(P>0.05);至再灌注3天及7天HIF-1 α表达消失(P<0.01或P<0.05)。培高利特可显著诱导海马CA1区神经元中HIF-1 α的表达，以再灌注1天表达最多(P<0.01)，随再灌注时间的延长表达缓慢减少，至第7天仍有较高水平的表达(P<0.01)。结论 培高利特可显著诱导脑I/R损伤后海马CA1区神经元HIF-1 α的表达，可能是其脑保护作用的机制之一。
【关键词】 脑缺血/再灌注损伤;培高利特;c-jun;神经元低氧诱导因子-1α;沙土鼠
Abstract: Objective To investigate the effects of pergolide on the expression of HIF-1α in hippocampal CA1 region folloeing transient forbrain ischemia/reperfusion (I/R) injury in gerbils. Methods Gerbil forebrain ischemia was induced by occlusion of bilateral carotid arteries for 5 min. 54 gerbils were randomly pided into sham group， I/R group and pergolide group. Immunohistochemistry was used to determine the expression of HIF-1α in hippocampal CA1 region on days 1， 3 and 7 after ischemia. Results There was a weak expression of HIF-1α in the sham group. In I/R group the expression did not have any evident change 1 day after ischemia but disappeared thoroughly 3 and 7 days after ischemia (P<0.01 or P<0.05). Pretreatment with pergolide could significantly induce the expression of HIF-1α. The expression of HIF-1 α reached its peak on day 1 and thereafter gradually decreased. The expression was still high on the 7th day after ischemia (P<0.01). Conclusion All these results indicate that pergolide plays an important role in the protection of hippocampal neurons from apotosis by inducing the expression of HIF-1α.
Key words: cerebral ischemia/reperfusion injury; pergolide; c-jun; hypoxia-inducible factor-1α; gerbil
缺血性脑病发病率很高，给社会和家庭造成极大的负担，因此脑缺血/再灌注(I/R)损伤的机制及脑保护的方法的研究具有非常重要的意义。迄今为止，脑I/R损伤的发病机制仍未完全阐明，临床治疗尚缺乏有效的保护策略和治疗手段。本研究旨在观察多巴胺D2受体激动剂培高利特(pergolide)对脑I/R损伤后1～7 天海马神经元HIF-1 α表达的影响，以期深入探讨其发挥脑保护作用的基因调控机制。
1 材料和方法
1.1 动物及分组 雄性健康沙土鼠54只，体重250～300 g，清洁级，随机分为假手术组、I/R组、培高利特组，每组根据再灌注时间的不同进一步分为再灌注1、3、7天3个亚组(每组6只)。
1.2 方法
1.2.1 动物模型制备 采用沙土鼠前脑I/R损伤模型[1]。沙土鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后，将动物头、四肢妥善固定仰卧于实验台上，切开颈部正中皮肤，钝性分离腺体及软组织，仔细分离双侧颈总动脉。手术第2天于大鼠清醒状态下结扎其双侧颈总动脉，使全脑缺血5 min，然后再灌注不同时间(第1、3、7天)。实验时监测脑电图，以夹闭双侧颈总动脉后1 min内脑电图呈等电位作为前脑缺血成功的标志，并将未呈等电位的沙土鼠从实验中剔除。监测鼓膜温度以间接反映脑温。整个实验过程将动物置于流动空气浴箱中，用灯泡加热或冰块降温的方法维持动物麻醉及I/R期间鼓膜温度在37.0℃～37.5℃。实验6 h后沙土鼠回笼。假手术组处理同实验组(即另外2组)，但不结扎双侧颈总动脉。缺血前30 min，培高利特组给予培高利特处理。
1.2.2 样品制备和免疫组织化学检测 各组于I/R第1、3、7天以水合氯醛麻醉，再以0.9%氯化钠溶液和4%多聚甲醛行心室灌注[2]。取其脑组织在4℃多聚甲醛中固定、二甲苯中透明，包蜡后的脑块进行切片(5 μm)，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，浸入配制好的柠檬酸/柠檬酸钠中，95℃水浴10 min，后用0.3% h3O2室温作用30 min，消除内源性辣根过氧化物酶(HRP)活性。PBS洗后血清封闭，室温1 h后PBS洗1遍，加一抗4℃过夜。次日吸去一抗，PBS洗3遍，以后的操作按VectABC试剂盒进行，即生物素标记的二抗4℃过夜，PBS洗3遍，HRP标记的生物素-卵白素复合物，37 ℃温盒孵育1 h，PBS洗4遍，最后用联苯二胺(DAB)显色。显色后梯度乙醇脱水、二甲苯透明，中性树脂封片，光镜下观察。对照实验以封闭液代替一抗，其余操作相同。
1.2.3 图像分析 免疫组织化学染色切片采用LEICA Qwin图像处理与分析系统进行图像分析。每组6只动物各取1张切片，每张切片取CA1区中1/3段3个区域测量平均灰度值，然后减去此片背景平均灰度值，取其相反数作为最终平均灰度值。
1.3 统计学处理 采用SPSS 10.0统计软件，数据以±s表示，组间比较采用方差分析及q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
假手术组沙土鼠海马CA1区HIF-1 α有较弱的表达，阳性染色分布于细胞质与细胞核。缺血组海马CA1区再灌注1天HIF-1 α表达有增多的趋势，但与假手术组相比差异无显著性(P>0.05);至再灌注3 天及7天HIF-1 α表达消失(P<0.01或P<0.05)。培高利特可显著诱导海马CA1区神经元中HIF-1 α的表达，表达至再灌注1 天时达高峰(P<0.01)，缓慢下降至第7 天时仍有较高的表达水平(P<0.01)。见表1。表1 培高利特对脑I/R损伤海马CA1区神经元HIF-1 α表达的影响与假手术组比较：*P<0.05，**P<0.01;与I/R组比较：##P<0.01
3 讨 论
HIF-1 是一种受低氧诱导而表达增强的核转录因子，由α和β 2个亚基构成，其中α亚基是其活性亚基。已证实人、大鼠、小鼠的心、脑、肾等多种组织在生理情况下均有少量HIF-1的表达[3]。目前HIF-1α在缺血缺氧性脑病中对细胞凋亡的调控作用已成为神经科学领域研究的热点，并存在许多争议。整体实验研究发现，HIF-1α可通过与低氧反应相关基因中的低氧反应元件(HRE)结合，促进促红细胞生成素(EPO)、血管内皮生长因子(VEGF)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、糖酵解酶、葡萄糖转移酶-1等的表达，对低氧下细胞凋亡有抑制作用[4-6]。另有研究表明，HIF-1α可通过Fas/FasL和caspase路径、增加野生型p53(wtp53)表达等机制介导神经元凋亡[7-9]。
多巴胺(DA)为中枢神经系统一重要的神经递质。近来研究发现，DA在脑I/R损伤中发挥重要作用。微透析法研究发现，短暂脑缺血可引起大鼠海马、纹状体等部位DA的大量释放，其细胞外浓度可达正常时的400～500倍。且细胞外液DA含量升高的程度与缺血性脑损伤的程度密切相关。损毁黑质-纹状体DA能神经通路或减少DA的合成与释放可减轻缺血性脑损伤。既往研究表明，DA的代谢产物醌及自由基产生的氧化应激是引起缺血易损区神经元凋亡的主要作用机制之一。
本实验发现，缺血可引起沙土鼠海马CA1区HIF-1α表达消失，神经元大部分凋亡，多巴胺D2受体激动剂培高利特可显著诱导HIF-1α的表达并抑制神经元凋亡，进一步支持HIF-1α对细胞凋亡有抑制作用。培高利特诱导HIF-1α的表达可能为其发挥脑保护的作用机制之一。
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