作者：蔡辉，郭寒，赵智明，蔡佳宇，郭郡浩
【摘要】 目的 探讨美托洛尔对充血性心力衰竭(心衰)大鼠血浆肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响。方法 雄性SD大鼠80只，随机分为空白组(n=10)及模型组(n=70)，模型组皮下注射异丙基肾上腺素2次(170 mg· kg-1)，6周后应用超声心动图检测，以左室射血分数≤45%确定造模成功，将心衰大鼠模型随机分为心衰对照组(n=13)、美托洛尔组(n=14);18周后使用左心导管进行血流动力学检查，利用放免法检测血浆TNF-α的改变并观察心肌病理形态学特征。结果 ①与空白组比较，心衰对照组心功能明显恶化，心室质量指数、左心室质量指数及血浆TNF-α显著升高(P<0.01 )，心室重构明显;②与心衰对照组比较，美托洛尔组心功能明显好转，心室质量指数、左心室质量指数及血浆TNF-α明显降低(P<0.05 )，心室重构好转。结论 美托洛尔能改善心功能，逆转心室重构，其作用可能与抑制心衰大鼠血浆TNF-α表达有关。
【关键词】 充血性心力衰竭;异丙基肾上腺素;美托洛尔;大鼠;肿瘤坏死因子-α;心室重构
Abstract: Objective To explore the effect of metoprolol on plasma tumour necrosis factor-α (TNF-α) in rats with congestive heart failure (CHF). Methods 80 male SD rats were randomly allocated to the isoproterenol (ISO)-induced heart failure group (n=70) receiving a subcutaneous injection of ISO (170 mg per kilogram of body weight) twice and the healthy normal group (n=10) receiving a subcutaneous injection of 0.25 ml of normal saline twice. At the 6th week， the left ventricular ejection fractions (LVEF) were measured by echocardiogram， the remaining rats， with a LVEF≤45%， were randomly pided into two groups: heart failure control group (n=13)， metoprolol group (n=14，8 mg/kg-1· d-1， i. g.， ). At the 18th week， the hemodynamic parameters were detected， including HR， LVEDP， LVSP and ±dp/dtmax; LVWI was measured after LV morphopathological examination. TNF-α in plasma was examined by radioimmunoassay. Results ①Compared with the normal group， the heart function significantly deteriorated; VWI， LVWI and the plasma TNF-α significantly increased (P<0.01) in the heart failure control group. ②Compared with the heart failure control group， the heart function markedly improved， and the VWI， LVWI and the plasma TNF-α decreased significantly (P<0.05 ) in the metoprolol group， with an improved ventricular remodeling. Conclusion Metoprolol can inhibit the plasma TNF-α， improve heart function and reverse ventricular remodeling with CHF. Its effect might be involved in the inhibition of the expression of plasma TNF-α in hear failure rats.
Key words: congestive heart failure; isoproterenol; metoprolol; rats; TNF-α; ventricular remodeling
充血性心力衰竭(congestive heart failure， CHF，心衰)是各种心血管疾病最终的共同转归，严重威胁着人类的健康。目前研究认为心衰是由于神经内分泌细胞因子系统的激活而介导的心室重塑过程[1]。在心衰的发生发展过程中，血浆肿瘤坏死因子-α(TNF-α)具有降低心功能、促进心衰发展的作用[2-3]。本研究以心衰大鼠为实验模型，观察美托洛尔对血浆TNF-α 的影响并探讨其意义。
1 材料和方法
1.1 实验药物 盐酸异丙基肾上腺素( isopreterenol， ISO; SIGMA;Lot No: I5627 );美托洛尔(metoprolol; AstraZeneca;Lot No: 0604045)。
1.2 造模及分组 9周龄清洁级雄性SD大鼠80只，购于南京中医药大学实验动物中心。将大鼠随机分为2组：模型组70只，皮下注射ISO (170 mg·kg-1， 分2次， 间隔24 h)，空白组10只，皮下注射生理盐水(NS)0.25 ml[4]。造模6周后，应用彩色超声监测仪(型号:HP SONOS 5500， 探头频率7.5 MHz)以二维成像模式在左室短轴切面位于乳头肌水平测量相关指标，测定值均为5个心动周期测定的均值。左室射血分数(LVEF)≤45%即为造模成功[5]。将造模成功大鼠随机分为心衰对照组(NS 0.1 ml· kg-1·d-1灌胃，n=13)和美托洛尔组(美托洛尔8 mg· kg-1·d-1灌胃，n=14)，同室常规饲养18周，饲养环境( 22±2 ) ℃，常规饲料喂养，自由饮水，观察大鼠的饮食、毛色、活动、紫绀、水肿等一般性状，每周称体质量(BW)。
1.3 血流动力学检测 18周实验结束，将各组大鼠腹腔注射麻醉，以自制充满肝素生理盐水的导管，经颈动脉插入左室腔，并连接压力换能器。分别测量左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末期压(LVEDP)、左心室内压最大上升和下降速率(±dp∕dtmax)，所有信息由BL-410生物机能检测系统记录并采用BL-New Century软件进行分析。检测结束后颈动脉放血，低温离心，分离血浆，密封，- 20℃ 冷存(备用)。
1.4 血浆TNF-α检测 采用放免法检测血浆TNF-α，放免试剂盒购于解放军总医院科技开发中心放免所(批号：20070203)。操作严格按照试剂盒说明书进行。
1.5 心脏组织病理学检查 采血完毕，采用脱颈法处死所有动物，迅速摘取心脏，肉眼观察后，剪去周围大血管，在冰生理盐水中洗净血液，滤纸吸干，称重。沿房室交界处去除左右心房，用电子天平(精确度0.000 1 g)称取心室质量(VW)，再剪去右心室游离壁，保留左心室及室间隔，称取左心室质量(LVW)。分别计算心室质量指数(VWI，VW/BW)、左心室质量指数(LVWI，LVW/BW)。所有标本于10%甲醛中固定24 h (4℃)，常规取材、脱水、石蜡包埋，沿左室长轴线每隔1 mm横断面切取5 张(层厚4 μm)切片，切片经苏木精-伊红染色、Masson三色染色。光学显微镜下观察：①心肌纤维有无肥大、变性、坏死;②间质有无充血、水肿、炎细胞浸润、结缔组织增生;③心内膜、心外膜有无充血、水肿、炎细胞浸润。各种病变按由轻到重的程度分别评分为1、2、3、4分，无病变为0分[6]，累加每组每只动物所有分数，并进行统计学处理。
1.6 统计学处理 采用SPSS 11.5 软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，组间均数比较采用t检验，率的比较采用χ2 检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 一般性状 与空白组相比，心衰对照组大鼠普遍出现：毛色暗黄，纳食减少，体质量增加缓慢，口鼻紫绀、有血性分泌物，明显气喘，足爪水肿，活动减少，抓取反应差。与心衰对照组相比，美托洛尔组大鼠心衰症状明显好转。
2.2 血流动力学检测结果 见表1。心衰对照组与空白组相比HR、LVEDP显著增加(P<0.01)，LVSP、±dp/dtmax明显下降(P<0.01)。美托洛尔组与心衰对照组相比HR、LVEDP 显著下降(P<0.01)，±dp/dtmax明显上升(P<0.05)。表1 18周大鼠血流动力学检测结果与心衰对照组比较：*P<0.05，**P<0.01;1 mmHg=0.133 kPa
2.3 TNF-α、心脏质量指数检测及病理评分结果见图1。心衰对照组与空白组相比血浆TNF-α、VWI、LVWI及病理评分显著升高(P<0.01);美托洛尔组与心衰对照组相比血浆TNF-α、VWI及LVWI明显下降(P<0.05)，病理评分显著下降(P<0.01)。
2.4 心脏组织病理学结果 空白组心脏表面光滑，颜色红润;心衰对照组心脏表面黯淡，颜色暗紫。光学显微镜下示：心衰对照组心肌细胞肥大，部分心肌细胞有嗜酸变性和(或)坏死，病变呈灶性或弥散性分布，主要位于左心室壁，部分大鼠心肌间质结缔组织增生，增生的结缔组织呈条索状或斑块状;美托洛尔组病变较心衰对照组明显减轻。苏木精-伊红染色结果显示(图2A～C)，空白组心肌细胞排列整齐，心肌纤维呈短柱状，可见横纹，心肌细胞核呈卵圆形，较大，着色较浅，位于肌纤维中央，未见心肌细胞肥大现象;心衰对照组可见肌纤维及间质发生坏死，心肌纤维增粗、拉长，胞核着色深，细胞排列疏松，横纹不清楚或消失，局部组织纤维化，间质内有炎性细胞浸润等;而美托洛尔组较心衰对照组明显好转。Masson染色结果显示(图2D～F)，空白组未见明显胶原组织增生;心衰对照组心肌细胞周围胶原组织明显增多，部分心肌组织被胶原组织取代，出现心肌纤维化，左心室心肌间质纤维胶原明显增多、增粗;美托洛尔组心肌细胞周围胶原组织含量和纤维化程度较心衰对照组明显减弱。图1 血浆TNF-α、心脏质量指数检测及病理评分结果
3 讨 论
TNF-α主要是由单核-巨噬细胞分泌的具有多种生物学效应的细胞因子，是导致CHF 心肌损伤的重要的前炎症细胞因子，其可引起左室收缩功能降低、心室重塑、氧自由基释放增加、心肌及内皮细胞凋亡等一系列病理生理改变[7]。血浆TNF-α 升高可导致心肌收缩力减弱、心脏扩大、左心室重构及运动耐量下降，从而促使心衰进一步加重，以致造成恶性循环。TNF-α也对成熟的心肌细胞及乳头肌细胞有浓度依赖性的负性肌力作用，用TNF-α持续灌注大鼠心脏，可导致时间依赖性的心室功能降低并使心脏扩大，可能与TNF-α可通过巨噬细胞、血管内皮细胞和心肌细胞中诱生型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的表达，导致心肌NO 产物增多，减弱心肌细胞的收缩功能有关[8-9]; TNF-α也可诱导氧化应激，使与心肌TNF-α及细胞表面受体结合激活与凋亡有关的基因过度表达，启动细胞凋亡，诱导心肌细胞凋亡发生，而导致心室扩张、间质纤维化[10]。此外，研究还发现TNF-α 可通过核转录因子(NF-κB)激活心肌组织金属蛋白酶，引起心肌重构，导致心功能减退[11]。
研究发现心衰患者经美托洛尔治疗后血浆TNF-α水平降低，心脏功能改善，左室重构逆转[12]。其机制可能是β受体阻滞剂美托洛尔可通过上调心肌细胞膜β 受体的数量而增加对儿茶酚胺的敏感性，降低肾素-血管紧张素和儿茶酚胺的水平，阻断氧化应激，清除氧自由基，防止心肌细胞内Ca2+超负荷，抗心肌细胞凋亡，改善心肌舒张期的充盈和顺应性，减少恶性心律失常的发生，从而达到改善心功能、逆转心室重塑、延缓心衰进程的作用[13-16]。
本实验结果显示：应用大剂量ISO皮下注射后模型组大鼠心衰表现明显，很好地复制了心力衰竭的临床表现;造模18周后血流动力学检测发现心衰对照组与空白组大鼠相比心功能明显下降;美托洛尔组与心衰对照组大鼠相比心功能明显改善。心脏病理形态学观察发现心衰对照组与空白组大鼠相比，心肌弥漫性坏死、纤维化及左室重构明显;美托洛尔组与心衰对照组相比心肌弥漫性坏死和纤维化明显好转，表明心衰大鼠经美托洛尔治疗后心肌纤维化和左室重构明显好转。与此同时，心衰对照组血浆TNF-α水平较空白组显著升高(P<0.01)，美托洛尔组较心衰对照组显著降低(P<0.05)，并且TNF-α升高和心脏病理评分一致。
本研究发现，ISO诱导CHF大鼠的血浆TNF-α显著上调并且心室重构明显，而美托洛尔干预能够降低血浆TNF-α及改善心室重构，提示血浆TNF-α在CHF的发病机制中发挥着重要作用。表明美托洛尔能够改善CHF大鼠的心功能及心室重构，该作用可能与降低血浆TNF-α浓度有关。
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