【摘要】 目的 研究还原型谷胱甘肽(GSH)对大鼠呼吸机相关性肺损伤(VILI)的保护作用。方法 24只健康雄性SD大鼠随机分为3组(每组n=8)，A组为自主呼吸组;B组为大潮气量机械通气组;C组为大潮气量机械通气加GSH处理组。B、C 2组呼吸参数：潮气量(VT)=30 ml/kg、频率(P)为40次/min、通气时间为4 h。每小时行1次动脉血气分析，计算氧合指数(PaO2/FiO2)。实验完毕收集肺组织和肺灌洗液标本。光镜观察肺组织病理形态改变， 免疫组化检测Fas/FasL蛋白，检测肺湿/干重比(W/D)、肺组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、肺灌洗液中白细胞计数、肿瘤坏死因子(TNF-α)和蛋白总量。结果 和A组比较，B组肺组织病理学改变明显， Fas/FasL蛋白增加， W/D、白细胞计数(WBC)、TNF-α、MDA等指标升高，而SOD及通气3 h以后PaO2/FiO2下降;和B组比较， C组肺组织病理学改变明显减轻， Fas/FasL蛋白质量减少， W/D、WBC、TNF-α、MDA等指标降低，SOD、PaO2/FiO2上升。结论 GSH对VILI有一定的保护作用。
【关键词】 呼吸机相关性肺损伤;机械通气; 还原型谷胱甘肽
Abstract： Objective To investigate the protective effects of reduced glutathione on ventilator-induced lung injury (VILI) in rats.Methods 24 male Sprague-Dawley rats were randomly pided into 3 groups (n=8 each): group A received room air without mechanical ventilation; group B received mechanical ventilation of large tidal volume(VT) with room air; group C was treated with mechanical ventilation of large tidal volume with room air plus reduced glutathione . The set parameters of mechanical ventilation in groups B and C: VT=30 ml/kg， breathing rate=40 times/min， and time of ventilation=4 h. Arterial blood gases were measured hourly to calculate oxygenation index (PaO2/FiO2). Rats were sacrificed and the lung lavage liquid and lung tissue were collected and stored with correct methods. The measured indexes including total protein， WBCs and TNF-α in bronchoalveolar lavage fluid (BALF)， wet-to-dry weight ratio (W/D) of lung， malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase(SOD) levels in the lung were assayed， respectively. Lung pathological changes and the expressions of Fas/FasL proteins were observed by microscopy.Results Compared with group A， total protein， W/D， WBCs， TNF-α， MDA and the expression of Fas/FasL proteins significantly increased in group B， while the levels of SOD， and PaO2/FiO2 at 3 h after ventilation significantly decreased. Compared with group B， total protein， W/D， WBCs， TNF-α， MDA and expressions of Fas/FasL proteins decreased in group C， and the levels of SOD and PaO2/FiO2 increased. Conclusion Reduced glutathione has certain protective effect on ventilator-induced lung injury.
Key words: ventilator-induced lung injury; mechanical ventilation; reduced glutathione
呼吸机相关性肺损伤(ventilator-induced lung injury， VILI)是肺功能严重受损的患者行机械通气支持治疗时的常见并发症;其发生率高达15%。而且长时间使用会增加急性呼吸窘迫综合征(ARDS) 和多器官功能障碍综合征(MODS)的发生率。VILI本质上是一种生物伤[1]，近些年来成为研究的热点。其致病机制之一可能是由于过度的机械刺激引起肺细胞内氧化应激，导致氧化-抗氧化系统失衡，从而激活多种和炎症密切相关的信号转导通路，使各种致炎因子的表达增多，引起炎性细胞在肺组织“募集”，从而造成肺损伤。因此，抗氧化剂可能对各类急性肺损伤有一定的保护作用。还原型谷胱甘肽(GSH)[2]是机体内重要的抗氧化剂，能够通过P38和JNK信号通路抑制促炎因子和清除机体内氧化物质。有研究表明GSH能明显减轻大鼠内毒素诱导的急性肺损伤[3]。本实验利用大鼠VILI为模型，研究GSH对大鼠VILI的保护作用。
1 材料和方法
1.1 实验动物及动物准备 健康雄性清洁级SD大鼠(徐州医学院实验动物中心提供)24只，体重(300±20) g。 10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔内注射麻醉后，气管切开及插入自制气管导管;行尾静脉穿刺保持静脉通道;行右颈内动脉置管，以4 U/(ml·h)速度输注肝素维持动脉通畅，每小时行1次血气分析，每次取血后从尾静脉补充注入等容量的胶体液以维持近似恒定的血容量;体温维持在37℃～38℃。
1.2 实验分组及动物模型 24只大鼠随机分为3组，每组8只。自主呼吸组(A组);大潮气量机械通气组(B组)， 维库溴铵〔1 mg/(ml·h)〕静脉输注抑制自主呼吸、维持肌松，接小动物呼吸机(浙江大学医学仪器厂，DH-150型)开始机械通气。呼吸参数设定：呼吸频率40 次/min，通气时间 4 h，吸呼比(I∶E)=1∶3，呼气末正压通气(PEEP)=0，潮气量(VT)=30 ml/kg;根据体重调节VT;大潮气量机械通气加GSH处理组(C组)，机械通气开始前30 min从尾静脉注射GSH 90 mg/kg，A、B 2组给予等量的生理盐水，呼吸参数同B组。大鼠大潮气量损伤性机械通气的动物模型是参考武庆平等[4]的相关实验研究并稍作修改制备的。
1.3 标本采集 通气4 h后，颈动脉放血处死大鼠。开胸取出肺脏，取1小块右上叶肺组织用作病理学检查及免疫组化检测，取右中叶肺称重;剩余右肺制成肺组织匀浆液:按每100 mg肺组织加入0.9 ml PBS(pH 7.4)，在冰浴下用组织匀浆器制成10%的肺组织匀浆。左肺用4℃生理盐水行支气管肺泡灌洗，每次灌洗量为2 ml，共灌洗3次，回收率大于90%，收集支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺匀浆液分别于4℃，3000 r/min离心15 min，取上清-70℃冻存;BALF离心后沉淀，用1 ml生理盐水稀释行白细胞计数。
1.4 检测指标及方法
1.4.1 病理学观察 右上叶肺组织用10%甲醛固定，经石蜡包埋切片、苏木精-伊红染色后，光镜观察病理学改变。
1.4.2 BALF中总蛋白含量 采用考马斯亮蓝染色法，用UV-2401型分光光度计测量光密度。
1.4.3 肺湿/干重比值(W/D) 取右中叶肺组织称湿重后置于烤箱中，70℃烘烤至恒重后称干重，计算肺W/D比值。
1.4.4 BALF中TNF-α含量 试剂盒由深圳晶美生物工程有限公司提供。采用双抗体夹心ELISA法，所有操作均严格按照试剂盒说明进行。先在酶标仪上测量标准品光密度并绘制出标准曲线，然后测量样品光密度，并根据测得的光密度在标准曲线上读出样品的浓度(ng/L)。
1.4.5 肺组织Fas/FasL蛋白表达 试剂盒由武汉博士德公司提供。肺组织经石蜡包埋切片免疫组化采用SABC法，DAB显色，实验步骤按试剂盒说明进行。采用Image Pro-plus 6.0细胞图像分析仪分析图像。在显微镜(×400)下以相同外部条件(亮度) 每张切片选择10个视野，设定灰度值50～250，计算平均灰度值。
1.4.6 肺组织SOD和MDA含量 试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。分别采用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法，所有操作均严格按照试剂盒说明进行。用UV-2401型分光光度计测量光密度。
1.4.7 氧合指数(PaO2/FiO2) 是指动脉血氧分压与吸入氧气浓度的比值，正常值应大于300，是反映换气功能较直接的指标，可动态反映患者的换气功能。
1.5 统计学处理 实验数据用±s表示，应用SPSS 13.0软件对数据进行单因素方差分析，两两比较采用q检验，P<0.05认为差异有显著性。
2 结 果
2.1 病理学改变 A组肺组织无明显病理学改变，肺泡间隔正常，偶见少量的炎性细胞。B组肺组织病理改变明显，肺泡间隔明显增厚，肺泡腔内可见较多的炎性细胞，部分肺泡腔内有渗出液;和B组比较，C组肺组织病理改变明显减轻，肺泡间隔一定程度增厚，肺泡腔可见少量炎性细胞浸润，部分肺泡腔有少量渗出物，但轻于B组。见图1。图1 3组大鼠肺组织病理学改变(苏木精-伊红染色，×40 )
A.A组;B.B组;C.C组
2.2 PaO2/FiO2肺W/D、MDA、SOD、BALF中总蛋白量、WBC和TNF-α含量的变化 和A组比较， B组通气3 h以后PaO2/FiO2均下降(P<0.05)，肺W/D、MDA、BALF总蛋白量、白细胞计数和TNF-α等各项指标均增高(P<0.05)，SOD下降 (P<0.05);C组通气3 h以后PaO2/FiO2高于B组(P<0.05)，肺W/D、MDA、BALF中总蛋白、白细胞计数和TNF-α等各项指标均低于B组(P<0.05)，SOD高于B组(P<0.05)。见表1、2。表1 各组大鼠不同时间点PaO2/FiO2的变化与A组比较:*P<0.05;与B组比较:▲P<0.05表2 各组大鼠BALF中总蛋白含量、WBC、TNF-α，肺W/D和肺组织MDA、SOD的比较与A组比较:*P<0.05;与B组比较:▲P<0.05
2.3 肺组织Fas/FasL蛋白的表达 2种蛋白表达阳性反应物质呈棕黄色， 主要位于细胞质中;阳性表达细胞为支气管黏膜上皮细胞、肺泡上皮细胞、炎性细胞(图2、3);免疫组化半定量结果:B组Fas/FasL蛋白表达明显高于A组(P<0.05)，C组则低于B组(P<0.05)。见表3。图2 SP法检测3组Fas蛋白表达(DAB染色，×400)表3 各组大鼠Fas、FasL蛋白的表达
3 讨 论
在急性肺损伤/ARDS患者治疗过程中常需要机械通气，然而机械通气也是导致急性肺损伤发病的机制之一，其致病机制十分复杂，包括氧化-抗氧化失衡在内的众多机制都会增加VILI的敏感性。Chess等[5]和Hammerschmidt等[6]研究机械通气可以加重肺的氧化应激反应，产生多种氧化物质。一系列研究表明[2，7-9]氧化应激状态下的肺组织细胞内氧化-抗氧化失衡如GSH氧化还原系统，GSH氧化型增加而还原型减少，能够通过P38和JNK信号通路释放出大量促炎因子和氧化物质，抗氧化物质减少;使机体清除氧化物质(如h3O2)能力减弱，产生细胞毒性，从而加重肺组织细胞损伤。同时，炎症因子能募集中性粒细胞进入肺泡腔，分泌蛋白酶类和大量活性氧类，释放炎症介质，造成肺泡毛细血管屏障的通透性增加，导致肺内炎症反应，进一步加重组织细胞损害[1]。尽管已经研究出许多不同的通气策略降低VILI的发生率，但它仍然是严重呼吸衰竭治疗过程中的一个重大问题。近年来，越来越多的研究致力于探索新的药物治疗生物伤方法。
GSH是人体内重要的抗氧化剂之一，是GSH氧化还原系统的组成部分，GSH有氧化型和还原型2种形式，可以互变[11]。该系统具有对抗氧自由基、保护肺组织免受氧化损伤的作用，被称为组织抗氧化系统。刘庆辉等[12]研究表明使用GSH前体N-乙酰半胱甘酸对VILI有保护作用。Hartl等[13]研究表明气道吸入GSH对肺的纤维化有保护作用。
大鼠大潮气量机械通气致肺损伤实验模型，是模仿临床上急性肺损伤/ARDS患者需要大潮气量通气治疗以及此类患者可能会发生婴儿肺[13]，即使采用小潮气量通气，但由于局部肺不张等原因在肺其他正常部位也会产生像大潮气量通气引起的肺损伤。Fas/FasL蛋白表达、肺W/D、PaO2/FiO2、BALF总蛋白可反映肺受损以及肺水肿的程度;WBC、TNF-α可反映白细胞的浸润以及炎症反应的水平;MDA是一种脂质过氧化产物，是检测体内脂质过氧化程度的客观指标。SOD在体内能清除生物氧化产生的自由基而对细胞起保护作用。本实验结果表明，B组大潮气量机械通气产生了明显的肺损伤，机体抗氧化应激能力下降，同时Fas/FasL参与了肺损伤过程。和B组相比， C组大鼠抗氧化能力增强，Fas/FasL表达下降，机械通气所致的肺损伤有所减轻，但重于A组。说明GSH能够增强机体抗氧化能力，抑制组织脂质过氧化的发生，减少Fas/FasL系统介导的凋亡，减轻组织水肿及中性粒细胞的聚集，对肺组织有一定的保护作用。其可能的作用机制:急性肺损伤时氧化应激增强， GSH在血中、肺泡上皮衬液及肺部其他细胞中含量降低[3，14]。静脉使用GSH增加肺细胞内外GSH含量，清除氧化产物，可能通过抑制P38和JNK通路抑制炎症递质的释放，减轻炎症反应;同时可能通过影响Fas/FasL抑制凋亡，减少肺和毛细血管的损伤。
上述结果说明GSH对大鼠VILI具有一定的保护作用，其作用机制可能与氧化、凋亡有关。但本实验没有观察VILI大鼠远期存活率及其作用的具体相关信号通路，仍需要进一步深入研究。
参考文献
[1] Halbertsma FJ， Vaneker M， Scheffer GJ， et al. Cytokines and biotrauma in ventilator-induced lung injury: a critical review of the literature [J].Neth J Med， 2005， 63 (10):382-392.
[2] Rahman I， MacNee W. Oxidative stress and regulation of glutathione in lung inflammation [J]. Eur Respir， 2000， 16(3):534-554.
[3] 张宏，刘文操.谷胱甘肽对内毒素致大鼠急性肺损伤的保护作用[J].广东医学，2007， 28(5):701-703.
[4] 武庆平，刘萍，王立奎，等.不同潮气量通气对大鼠呼吸机相关性肺损伤模型的影响[J].华中科技大学学报:医学版，2006， 35(4):511-515.
[5] Chess PR， O′Reilly MA， Sachs F， et al. Reactive oxidant and p42/44 MAP kinase signaling is necessary for mechanical strain-induced proliferation in pulmonary epithelial cells [J]. J Appl Physiol， 2005， 99(3): 1226-1232.
[6] Hammerschmidt S， Sandvoss T， Gessner C， et al.High in comparison with low tidal volume ventilation aggravates oxidative stress-induced lung injury [J]. Biochimica Biophysica Acta， 2003， 1637(1):75-82.
[7] Chapman KE， Sinclair SE， Zhuang D， et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells [J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol， 2005， 289(5):834-841.
[8] Jafari B， Ouyang B， Li LF， et al. Intracellular glutathione in stretch-induced cytokine release from alveolar type-2 like cells [J]. Respirology， 2004， 9(1): 43-53.
[9] Papaiahgari S， Yerrapureddy A， Hassoun PM，et al. EGFR-activated signaling and actin remodeling regulate cyclic stretch-induced Nrf2-ARE activation [J]. Am J Respir Cell Mol Biol， 2006 36(3): 304-312.
[10] Lauterburg BH. Analgesics and glutathione [J]. Am J Ther， 2002， 9(3):225-232.
[11] 刘庆辉，俞森洋，刘岩，等.N-乙酰半胱氨酸对高浓度氧和通气机联合所致大鼠急性肺损伤的防护作用[J]. 中国老年学杂志，2007，27(9):830-832.
[12] Hartl D， Starosta V， Maier K， et al. Inhaled glutathione decreases PGE2 and increases lymphocytes in cystic fibrosis lungs [J].Free Radic Bio Med， 2005， 39(4):463-472.
[13] Gattinoni L， Carlesso E， Cadringher P， et al. Physical and biological triggers of ventilator-induced lung injury and its prevention [J]. Eur Respir J Suppl，2003，47:15S-25S.
[14] Kristof AS， Goldberg P， Laubach V， et al. Role of inducible nitric oxide synthase in endotoxin-induced acute lung injury [J]. Am J Respir Crit Care Med，1998，158(6):1883-1889.