作者：王庆苓，黄亚红，柳红，侯亚义
【摘要】 目的 研究shRNA 干扰midkine对胃肿瘤细胞BGC823增殖能力及凋亡的影响。方法 构建midkine基因的特异性小RNA干扰质粒，采用脂质体2000转染BGC823细胞，运用CCK-8检测细胞的增殖能力，PI染色检测细胞凋亡情况。结果 成功转染重组体的BGC823细胞增殖明显受到抑制(P<0.01)细胞形成克隆数明显降低(P<0.01)，并且有明显的亚二倍体峰出现(P<0.05)。结论 针对midkine基因的特异性小RNA干扰质粒在体外能有效抑制人胃癌细胞BGC823 midkine表达，细胞增殖能力减弱，细胞凋亡增加，为midkine 基因靶向治疗提供一定的实验依据。
【关键词】 midkine;shRNA;胃肿瘤细胞;细胞增殖;细胞凋亡
Abstract: Objective To investigate the effect of knockdown of midkine (MK) expression by shRNA on cell proliferation and apoptosis of human gastric carcinoma cell BGC823. Methods Specific shRNA plasmids to midkine were constructed， and were then transfected into BGC823 by lipofectamin 2000. The cell proliferation was evaluated by CCK-8 kit， and the apoptosis was determined by flow cytometric analysis. Results The recombinant plasmid expressing midkine shRNA effectively inhibited BGC823 cell proliferation (P<0.01) and decreased clone formation (P<0.01) and significantly promoted cell apoptosis with the emergence of sub-diploid peak (P<0.05). Conclusion shRNA plasmids targeting MK gene can inhibit the growth of human gastric cancer cells by attenuating cell proliferation and inducing apoptosis， which might provide experimental evidence for gene targeting therapy of MK.
Key words: midkine; shRNA; gastric cancer cell; cell proliferation; apoptosis
Midkine(MK)是一种肝素结合生长因子，MK在多种正常组织中也有表达，在小肠黏膜组织高表达，在肺、结肠、胃、肾和脾低表达，在肝脏中没有表达，MK在多种肿瘤组织中的表达比相应的癌旁和正常组织高[1]。在我们前期研究工作[2]中发现MK在中国胃肿瘤患者的肿瘤组织中高表达，并与临床分级相关。在多种肿瘤细胞系中，MK具有促纤溶、促血管形成和抗凋亡作用，能诱导NIH/3T3细胞、SW-13细胞和 UNUC3细胞转化[1， 3]。胃癌患者的尿液和血清中的MK水平都有所增加[4-5]，肿瘤切除后血清MK水平就会下降[6]。这些资料表明MK与胃肿瘤的发生发展相关，可作为诊断指标和治疗靶标。本研究旨在以MK为靶标进行干扰，观察MK干扰后胃肿瘤细胞增殖及凋亡情况。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 肿瘤细胞 BGC823细胞株购自中国科学院细胞所。
1.1.2 pSilencer 2.1 U6 和pSilencer 3.1H1载体 pSilencer 2.1 U6 和pSilencer 3.1H1载体购自Ambion公司，pSilencer 2.1 U6的载体含有U6 RNA聚合酶Ⅲ启动子;pSilencer 3.1H1载体含有H1 RNA聚合酶Ⅲ启动子。两者都同时含有氨苄青霉素和G418抗性基因，前者可用于在原核细胞的筛选，后者则可用于在真核细胞的筛选。2个载体在购买时呈开环的线状，两端分别留有BamHI和HindⅢ的酶切位点。
1.1.3 主要试剂 PI为南京凯基生物公司产品;Llipofectamin 2000转染试剂和Opti-MEM购自Invitrogen公司;各种限制性内切酶、总RNA提取试剂盒、质粒抽提试剂盒、反转录试剂盒、核酸电泳试剂均为TaKaRa公司产品;PCR扩增试剂为天为时代公司产品。
1.2 方法
1.2.1 发夹状双链MK-siRNA基因序列的合成 根据前面研究中MK-siRNA序列[7]设计发夹双链RNA基因序列，正义链：5′GATCCGTGAAGAAGGCGCGCTACAATGCTCATTCAAGAGATGAGCATTGT
AGCGCGCCTTCTTCATTTTTTGGAAA′;反义链： 5′AGCTTTTCCAAAAAATGAAGAAGGCGCGCTACAAT
GCTCATCTCTTGAATGAGCATTGTAGCGCGCCTTCT
TCACG3′。序列由Ivitrogen公司合成。合成的MK发夹状双链RNA基因序列的两端分别引入BamHI和HindⅢ两个酶切位点。然后，按照下列方法把合成的2条单链DNA配对形成双链：以50 μl去离子分别溶解合成的2条单链DNA;分别取5 μl溶解的单链DNA，然后加入40 μl 1×DNA退火溶液(100 mmol/L醋酸钾、30 mmol/L pH 7.4 Hepes、2 mmol/L 醋酸镁)混合;90℃ 3 min，冷却至37℃并保温1 h，逐步冷却至室温，这样2条单链DNA就配对形成了双链，并且其两端设计合成的BamHI和HindⅢ黏性末端也暴露出来了。-20℃保存备用。
1.2.2 pSilencer 2.1-U6-mksiRNA和pSilencer 3.1-H1-mksiRNA质粒的构建 购买的pSilencer 2.1-U6和pSilencer 3.1-H1是已经含有BamHI和HindⅢ酶切位点的线形载体，故可以用以下方法连接上述已经配对形成双链的MK发夹状RNA的基因：1 μl MK发夹状RNA的基因， 6 μl ddh3O，1 μl 10×T4 DNA连接缓冲液，1 μl pSilencer 2.1-U6或pSilencer 3.1-H1载体，1 μl T4 DNA 连接酶 (5 U/μl)，把上述液体混合均匀，16℃ 过夜，转化感受态E.coli DH5α，随机挑取菌落于含100 mg/L氨苄青霉素的液体LB培养基中扩增细菌，进行测序，序列正确的即为pSilencer 2.1-U6-mksiRNA和pSilencer 3.1-H1-mksiRNA质粒。对照质粒插入的片段为针对GFP的序列，称为pSilencer 2.1-U6和pSilencer 3.1-H1。
1.2.3 构建质粒的转染和阳性克隆的筛选 肿瘤细胞在24孔板上用PRMI-1640培养基，含10%的小牛血清和青霉素、链霉素在37℃ 5% CO2细胞培养箱中培养至90%～95%的细胞覆盖率。然后，吸去培养液，用不含青霉素、链霉素和小牛血清的PRMI-1640培养基洗1次。细胞转染按Lipofectamin 2000质粒转染操作说明进行操作，质粒用量为0.8 μg，转染后37℃ 5% CO2下培养72 h。
1.2.4 总RNA提取、Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) RNA提取按照TRIzol试剂盒操作指南进行，并通过琼脂糖凝胶电泳检测提取的总RNA的完整性。反转录依照试剂盒操作说明进行，总反应体系为25 μl，反转录条件为42℃反应60 min， PCR引物：MK (385 bp，28个循环)，上游的引物： 5′AAAAAAGCTTATGAAAAAGAAAGATAAGGTGAAGAAG 3′。下游引物：5′ AAAAGAATTCCTAGTCCTTTCCCTTCCCT 3;β-actin (280 bp，28个循环)，上游引物：5′CCACGAAACTACCTTCAACTCC 3′;下游引物：5′TCATACTCCTGCTGCTTGCTGATCC 3′。cDNA产物直接取2 μl加入PCR反应体系进行PCR扩增。PCR反应程序为：94℃ 变性30 s，55℃ 退火30 s，72℃延伸 30 s，28个循环后，72℃维持5 min，反应结束后，取5 μl 反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，鉴定扩增产物。
1.2.5 细胞增殖活力检测 细胞增殖活力检测参照CCK8-kit说明书进行操作，详细方法如下：将转染pSilencer 2.1-U6-mksiRNA和pSilencer 3.1-H1-mksiRNA、空载体和未转染的细胞悬液按100 μl/孔加入96孔培养板中，每组孔做6个复孔。37℃ 5% CO2饱和湿度下培养。在1、2、3、4、5天，每孔中加入10 μl WST-8 〔2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2，4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium， monosodium salt〕，置37℃ 5% CO2饱和湿度继续培养4 h，于酶标仪(HynergyTM HT，BIO-TEK， USA)450 nm处比色，获得光密度(D)值。
1.2.6 平板克隆形成实验 将不同处理并对数生长期细胞接种到6 孔板，每种细胞接种3 孔，1 000 个/孔，以十字方向轻轻晃动6孔板，使细胞分散均匀。在37℃、5% CO2的培养箱中，静止培养7～10天至6 孔板出现肉眼可见的克隆[7]。PBS小心洗涤细胞2 次，甲醇固定30 s，0.1%结晶紫液染色15 min，流水缓慢洗去染色液，空气干燥。凝胶成像系统拍照计数克隆数。
1.2.7 PI检测亚二倍体峰 不同处理的细胞，胰酶消化PBS洗，2 000 rpm(约375 g)，离心5 min，获得细胞(107/ml);取100 μl细胞悬液，加入1 ml 70%乙醇(用过滤除菌的双蒸水配制)固定2 h;用PBS洗细胞2次， 4℃，2500 r/min，5 min×2次;100 μl PBS(2% TritonX-100，2%RNaseA)重悬细胞;加入100 μl PI染液，4℃避光显色30 min;4℃，加300 μl PBS;流式细胞仪(flow cytometer， FCM)检测[8]。
1.3 统计学处理 实验数据用±s表示，利用one-way ANOVA进行组间统计学分析，P<0.05认为差异有显著性。每个实验至少重复3次。
2 结 果
2.1 MK干扰后mRNA表达水平的检测 将构建的pSilencer 2.1-U6-mksiRNA和pSilencer 3.1-H1-mksiRNA质粒利用Lipofectamin 2000转染到BGC823细胞，通过RT-PCR检测双链发夹RNA对MK的抑制作用。pSilencer 2.1-U6-mksiRNA和pSilencer 3.1-H1-mksiRNA转染72 h，在BGC823细胞中MK的mRNA表达水平都明显降低，而β-actin的表达没有受到影响。空载体对MK和β-actin的表达均没有影响 (图1)。2种质粒的干扰效果相比没有明显差别。
图1 MK干扰后通过RT-PCR MK mRNA表达水平检测
M：DL2000;1：pSilencer3.1-H1-mksiRNA处理组;2：pSilencer2.1-U6-mksiRNA处理组;3：pSilencer3.1-H1处理组;4：pSilencer2.1-U6处理组;5:未转染细胞
2.2 双链发夹MK RNA对细胞生长的抑制作用 为检测低表达的MK对BGC823细胞生长状况的影响，细胞存活能力用CCK8-kit检测。在第1、2、3、4、5天，与未转染细胞和转染空载体的细胞相比，转染了siRNApSilencer 2.1-U6-mksiRNA和pSilencer 3.1-H1-mksiRNA质粒的BGC823细胞增殖能力明显受到抑制 (图2)。从集落形成实验结果(图3)可以看出转染了psiRNApSilencer 2.1-U6-mksiRNA和pSilencer 3.1-H1-mksiRNA质粒的BGC823细胞的克隆数与对照组相比降低了约4倍。这些结果说明MK-shRNA能显著的抑制BGC823细胞的生长。转染了siRNApSilencer 2.1-U6-mksiRNA和pSilencer 3.1-H1-mksiRNA质粒的BGC823细胞增殖能力受抑制程度没有明显差别。后面的实验选用pSilencer 3.1-H1-mksiRNA质粒转染细胞。
2.3 双链发夹MK RNA促细胞凋亡的作用 处于增殖周期中的细胞，根据其所处的周期不同(G0/G1、S、G2/M)，其DNA含量分布在2～4倍体之间。发生凋亡的细胞由于细胞内的DNA断裂成许多小片段，在用乙醇固定后，用细胞膜通透剂(DNA抽提液)使小分子量的DNA片段穿过细胞膜，使细胞内原有的DNA部分的丢失，仅剩下大片段的DNA，这些细胞在DNA染色后，用流式细胞检测术检测其DNA含量，会出现1个DNA含量<2倍体(即
转染pSilencer 3.1-H1-mksiRNA质粒以后，BGC823细胞的凋亡百分比为31.76%，而对照组没有转染的细胞凋亡百分比小于2%，转染空载体pSilencer3.1-H1的细胞凋亡百分比小于4.5%(图4A)。对流式细胞仪分析结果进行统计分析，结果如图4B(3次实验的平均值)所示，与未转染细胞和转空载体的细胞相比，转染了pSilencer 3.1-H1-mksiRNA质粒的BGC823细胞凋亡数明显增多，具有统计学意义，转染空载体细胞与未转染细胞相比细胞凋亡数的差别无统计学意义。
3 讨 论
近年来以MK为靶标进行疾病治疗得到了关注，小鼠MK反义寡核苷酸能抑制直肠癌细胞CMT-93的生长[9];Morpholino antisense oligomer能抑制PC-3细胞和SW620细胞体外生长和体内成瘤[10]。但是，反义寡核苷酸技术抑制特定基因的表达存在着其自身不可克服的缺点：①作为分子探针的反义寡核苷酸只能外源合成，再注射到体内发挥作用;②反义寡核苷酸在合成时为避免被体内各器官组织中的核酸酶分解，都必须进行修饰。因此，利用反义寡核苷酸药物进行治疗成本高、疗程长，在治疗过程中必须连续多次给药才能保证体内的反义寡核苷酸浓度。而且长时间注射外源反义寡核甘酸有可能在体内引发干扰素的产生，导致非特异阻断基因的表达。与反义寡核苷酸技术相比，RNA干扰技术(RNA interference， RNAi)更灵敏，可避免干扰素效应，能高效、特异地引起基因转录后沉默，使其丧失表达蛋白或多肽的能力，并且可以通过多种方法给药。目前，RNAi技术已广泛应用于基因功能、信号传导通路的研究以及基因治疗新策略的研究。
我们前期研究发现针对MK特异的siRNA能有效抑制细胞增殖、并促进细胞凋亡[11]。在本研究中我们使用的shRNA是由RNA聚合酶Ⅲ启动子(U6和H1)从DNA模板上转录产生的，其对哺乳动物细胞能产生RNA干扰作用。RNA聚合酶Ⅲ的优势在于能直接从5′-3′转录产生小的非编码RNA，并在遇到4～5个连续的T后就中止转录。RNA聚合酶Ⅲ启动子的这种特性使得它在体内从DNA模板上转录出的siRNA与在体外合成的siRNA的活性非常一致[12]。本实验结果表明转染pSilencer 2.1-U6-mksiRNA或pSilencer 3.1-H1-mksiRNA质粒可以明显抑制胃肿瘤细胞BGC823生长(图2)，并且促进细胞凋亡(图4)，效果与直接使用siRNA 一致[11]，另外与直接使用siRNA相比可以大大节省成本，并且可以实现稳定转染，但两种启动子的转录效果没有差别。
总之，本研究证明，RNA聚合酶Ⅲ启动子启动转录产生的针对MK的 shRNA可以抑制胃肿瘤细胞BGC823生长并促进细胞凋亡，这为MK基因靶向治疗提供一定的实验依据。
参考文献
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