【摘要】 目的 探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对高糖诱导大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK-52E转分化的干预作用。方法 细胞培养72 h后，Western blot检测对照组(0 mmol/L葡萄糖)、高糖组(25 mmol/L葡萄糖)、血管紧张素Ⅱ干预组(10 nmol/L AngⅡ)、高糖血管紧张素Ⅱ干预组(10 nmol/L AngⅡ+25 mmol/L葡萄糖)中转化生长因子β1(TGF-β1)、Ⅰ型胶原、金属蛋白酶2(MMP2)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及甲状旁腺素相关肽(PTHrP)在NRK-52E细胞中的表达。活性氧(ROS)含量应用CM2h3DCFDA试剂盒检测。结果 高浓度葡萄糖上调TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA以及PTHrP表达。AngⅡ明显上调高浓度葡萄糖状态下TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA和PTHrP的表达，并提高ROS含量。结论 AngⅡ可以促进高浓度葡萄糖诱导肾小管导管上皮细胞转分化。
【关键词】 血管紧张素Ⅱ;葡萄糖;NRK-52E 细胞;转分化
Abstract： Objective To investigate the effect with angiotensin Ⅱ intervention on hyperglycemia-induced transdifferentiation in the epithelioid clone of mixed culture of normal rat kidney (NRK-52E) cells. Methods 72 hours after intervention， the expression of transforming growth factor-β1 (TGF-β1)， type Ⅰ collagen， matrix metallopeptidase 2 (MMP2)， α-smooth muscle actin (α-SMA) and parathyroid hormone-related protein (PTHrP) in NRK-52E cells was detected with Western blot in the control group (0 mmol/L glucose)， high glucose group (25 mmol/L glucose)， angiotensin Ⅱ (10 nmol/L angiotensin Ⅱ) group and angiotensin Ⅱ plus high glucose (10 nmol/L angiotensin Ⅱ+25mmol/L glucose) group， respectively; and the levels of reactive oxygen species (ROS) were detected by kit CM2h3DCFDA. Results The expression of TGF-β1， type Ⅰ collagen， MMP2， α-SMA and PTHrP were up-regulated by hyperglycemia; angiotensin Ⅱ markedly up-regulated TGF-β1， type Ⅰ collagen， MMP2， α-SMA and PTHrP in the high glucose condition and increased ROS levels. Conclusion Angiotensin Ⅱ could promote the hyperglycemia-induced transdifferentiation in NRK-52E cells.
Key words： angiotensin Ⅱ; glucose; NRK-52E; transdifferentiation已换
醛固酮-血管紧张素Ⅱ-肾素系统(RAS系统)是体内重要的内分泌调节系统，在肾脏局部微炎症状态RAS系统常被激活。肾小管上皮细胞转分化是肾脏纤维化的重要病理基础，有研究发现高浓度葡萄糖通过激活RAS系统，进一步诱导肾小球纤维化[1]，但对于肾小管导管上皮细胞的研究并不清晰。因此， 本实验应用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)干预持续性高葡萄糖状态下大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK-52E，观察各种调控肾小管导管上皮细胞转分化的因子及其标记物，包括转化生长因子β1(TGF-β1)、Ⅰ型胶原、金属蛋白酶2(MMP2)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及甲状旁腺素相关肽(PTHrP)的表达，以探讨AngⅡ对肾小管导管上皮细胞转分化的影响。
1 材料和方法
1.1 试剂和仪器 DMEM培养液(美国GIBCO公司)，胎牛血清(美国Sigmaaldrich公司)，AngⅡ(美国Sigma aldrich公司)，一抗试剂(PTHrP、Ⅰ型胶原均购于美国Santa cruz公司，TGF-β1、MMP2购于英国ABCam公司，α-SMA购置于美国Dako公司)，HRP标记的Rabbit anti-Mouse二抗(美国Dako公司)，电泳仪(美国BIO-RAD公司)，扫描仪(美国GE公司)，酶标仪(美国BioTek公司)。
1.2 细胞培养 大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK-52E购自中科院细胞库，DMEM培养液加入10 ml胎牛血清、1 ml双抗(青、链霉素各1×105 U/L)、1 mmol/L EDTA。每周传代2～3次。
1.3 实验分组与处理 ①空白对照组(control组)：无糖培养基，未进行干预。②高糖组(Glu组)：含25 mmol/L葡萄糖DMEM培养基培养。③血管紧张素Ⅱ干预组(AngⅡ组):无糖DMEM培养基加入10 nmol/L AngⅡ干预。④高糖血管紧张Ⅱ素干预组(Glu+AngⅡ组)：DMEM培养基中加入25 mmol/L葡萄糖、10 nmol/L AngⅡ干预。各组设3复孔。均在37℃、5% CO2条件下培养3天，每24 h换液1次。
1.4 Western blot检测蛋白表达 进行常规细胞裂解获取蛋白后，与预染蛋白Marker一起上样，经分离胶和浓缩胶进行SDS-PAGE电离，完毕后将蛋白质电转印到PVDF膜上，将膜放入含100 g/L脱脂奶粉的TBST中封闭，4℃过夜，然后与TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA以及PTHrP等一抗分别按1∶100、1∶75、1∶125、1∶75及1∶50的比例室温孵育90 min(α-SMA及Ⅰ型胶原4℃过夜)，用TBST液洗膜5 min×3次，PVDF膜分别与辣根过氧化物酶标记的相应二抗(1∶1000)室温孵育45 min后，用TBST液洗膜3次，每次5 min。用ECL显色试剂盒显示目的条带。Western blot图片检测采用Gel.Doc-It imaging system扫描分析仪扫描凝胶图谱，采用Total Lab分析软件对条带进行密度扫描分析。
1.5 活性氧(ROS)检测 经处理72 h的各组细胞加入10 μl 的1 mmol/ L CM2h3DCFDA(美国Invitrogen 公司，终浓度为10 μmol/L ) 染色液， 37℃避光孵育30 min， 离心， PBS洗2次，重悬于1 ml 含10%胎牛血清的DMEM培养液中。用全自动定量绘图酶标仪检测光密度(D)值， 激发波长485 nm，发射波长528 nm。
1.6 统计学处理 所有实验均重复3次。应用SPSS 11.5统计软件，采用One-Way ANOVA-SNK法比较总体和组间差异，检验水准α=0.05。
2 结 果
2.1 AngⅡ对高糖诱导NRK-52E细胞株中各种肾小管导管上皮细胞转分化调控因子表达的影响 结果见图1。Glu组、AngⅡ组TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA及PTHrP的表达明显高于control组，但2组间无明显差异;Glu+AngⅡ组TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA以及PTHrP的表达明显高于AngⅡ组，Glu+AngⅡ组TGF-β1、α-SMA以及PTHrP的表达明显高于Glu组。提示AngⅡ能明显促进高浓度葡萄糖状态下TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA以及PTHrP的表达。
2.2 AngⅡ对高糖诱导NRK-52E细胞株ROS含量影响 结果见图2。Glu+AngⅡ组ROS含量明显高于control组及Glu组，提示AngⅡ能明显促进高浓度葡萄糖状态ROS含量水平。
3 讨 论
糖尿病肾病最终转归为肾功能衰竭，其发生机制主要是肾脏纤维化。有研究表明高血糖通过微炎症状态诱导肾组织纤维化是其最重要的病理基础，而微炎症状态常常激活RAS系统，进而恶性循环不断促进肾脏组织纤维化[1]。然而对于肾小管导管上皮细胞转分化为成纤维细胞等的研究却很少见，为此本研究目的为探讨其机制。
本研究提示，在高浓度葡萄糖或AngⅡ分别作用72 h后， NRK-52E细胞TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA以及PTHrP表达水平均明显上调。既往研究提示，高浓度葡萄糖通过诱导肾小管导管上皮转分化，主要通过上调TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA以及PTHrP等蛋白水平，从而加重肾小球硬化及肾间质纤维化[2-5]，而AngⅡ同样可以从多个水平影响炎症通路信号转导，从而加重纤维化的进程[6-7]。故此表明高血糖及AngⅡ均可能通过上调TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA以及PTHrP等多种蛋白水平，参与糖尿病肾小管导管上皮转分化病程。
为进一步阐明AngⅡ对于高浓度葡萄糖状态下肾小管导管上皮转分化进程的干预作用，本研究应用AngⅡ在不同条件下干预NRK-52E细胞株，结果发现，AngⅡ能明显上调高浓度葡萄糖状态下TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA以及PTHrP的表达。 Liu等[8]研究也提示AngⅡ高度表达能通过促进TGF-β1等系列因子表达从而加剧糖尿病肾脏功能损害。说明AngⅡ能明显促进TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA以及PTHrP等蛋白表达，从而可能促进肾小管导管上皮细胞转分化。
在进一步研究中发现AngⅡ同时能明显提高高糖状态下NRK-52E细胞株ROS含量，由于氧化应激是诱导肾小管导管上皮转分化重要因子[6-7]，本组结果也进一步验证了AngⅡ可能加剧高糖状态下肾小管导管上皮细胞转分化的进程。
参考文献
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