HPLC法测定左卡尼汀注射液含量及有关物质

　　　　　　 作者：闵翠娥，陆媛，江少仪，谭胜连

【摘要】 目的 建立测定左卡尼汀注射液含量及有关物质的方法。方法 采用高效液相色谱法，色谱柱：MCPack Nh3色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);流动相：0.05 mol·L-1磷酸盐缓冲液乙腈(体积比35∶65)，磷酸调节pH至4.3;检测波长：205 nm;流速：1 mL·min-1;柱温：30 ℃。结果 左卡尼汀在1.04～8.30 mg·mL-1质量浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系，r=0.999 9;高、中、低3种浓度的平均回收率为100.7%，RSD为1.4%。左卡尼汀的检测限为3 ng，有关物质(E)4(三甲基氨基)2丁烯酯或(Z)4(三甲基氨基)2丁烯酯的检测限为0.02 ng。结论 该法简便、准确、灵敏度高，重现性好，适用于左卡尼汀注射液的质量控制。

【关键词】 高效液相色谱法;左卡尼汀;注射液;有关物质;质量控制

　Abstract:Objective To establish a HPLC method for the determination of levocarnitine Injection and its related substances.Method The HPLC was carried out on a YMCPack Nh3(150 mm×4.6 mm，5μm) column with a flow rate of 1.0 mL·min-1 at column temperature 30 ℃，of which the mobile phase was consisted of 0.05 mol·L-1 solution of phosphate buffer and acetonitrile (35∶65，pH4.3) and the detected UV wavelength was 205 nm. Results The calibration curve was linear (r=0.999 9) in the range of 1.04～8.30 mg·mL-1 for levocarnitine，and the average recovery was 100.7%，with RSD 1.4%. The limit of detection was 3 ng for levocarnitine and 0.02 ng for its impurity A. Conclusion It is an accurate，simple，rapid，qualitative method with good reproducibility for the determination of levocarnitine and its related substances.

　　Key words:HPLC;Levocarnitine; Injection; related substances; quality control

　左卡尼汀是一种能量代谢所需的体内天然物质，其主要功能是促进脂类代谢，在细胞相互作用，抗氧化、改变膜性质及调节免疫应答等方面也具有重要作用，已广泛应用于医疗、保健、食品和饲料添加剂等领域。目前文献报道的左卡尼汀含量测定方法有几种，但均有不足之处。我们采用文献[1]所收载的HPLC法，选用不同的C18柱、pH值或流动相比例均难以分离左卡尼汀主成分和杂质A[(E)4(三甲基氨基)2丁烯酯或(Z)4(三甲基氨基)2丁烯酯];文献[2]采用酶法，操作繁杂，干扰因素多，重复性差;美国药典[3]采用的HPLC法，分析时间长(3 h)，且基线很难平衡。而欧洲药典[4]、英国药典[5]收载的左卡尼汀原料中有关物质检查的HPLC法，所选用的色谱柱为丙胺基甲基硅烷键合硅胶柱(aminopropylmethylsilyl silica gel)，在国内尚未找到相应的色谱柱。本文在欧洲药典[4]、英国药典[5]左卡尼汀原料有关物质测定方法的基础上，结合美国药典[3]左卡尼汀注射液的含量测定方法，建立了左卡尼汀注射液含量及有关物质的测定方法。

　　1 仪器与试药

　　日本岛津LC10A高效液相色谱仪(LC10AT泵、SPD10A紫外可见检测器、CTO10A柱温箱、HW2000工作站)，sartorius PB21酸度计，Metler Toledo AG135电子天平。

　　左卡尼汀对照品(USP，批号：1359903，质量分数100%)、杂质A对照品(EP，批号：BP907F67029，质量分数100%)。左卡尼汀注射液分别由本公司(规格：5 mL∶1.0 g，批号：080301、080302、080303)和意大利SigmaTau公司(规格：5 mL∶1.0 g，批号：070864)提供。乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为超纯水。

　　2 方法与结果

　　2.1 溶液的制备

　　2.1.1 供试品溶液的制备 精密量取本品适量，加流动相制成每1 mL中约含左卡尼汀5 mg的溶液，即得。

　　2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取左卡尼汀对照品适量，加流动相制成每1 mL中约含有左卡尼汀5 mg的溶液，即得。

　　2.2 色谱条件及系统适用性试验

　　色谱柱：YMCPack Nh3 柱(4.6 mm×150 mm，5μm);流动相：0.05 mol·L-1磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾6.81 g，加水溶解并稀释至1 000 mL，摇匀)乙腈(体积比35∶65)，磷酸调节pH值至4.3;流速：1 mL·min-1;柱温：30 ℃;检测波长：205 nm;进样量：20 μL。分别取左卡尼汀对照品、杂质A对照品适量，加流动相配制成含左卡尼汀5 mg·mL-1、杂质A 0.025 mg·mL-1的溶液，取20 μL，进样，记录色谱图。理论塔板数按左卡尼汀峰计算为804 9，拖尾因子1.12，左卡尼汀与杂质A分离度为2.6。见图1。

　　2.3 专属性试验

　　分别取空白辅料溶液及“2.1”项下的供试品溶液、对照品溶液各20 μL，进样，结果表明空白辅料不干扰左卡尼汀含量测定。见图2。

　　2.4 破坏试验

　　2.4.1 酸破坏 精密量取本品1 mL，置20 mL容量瓶中，加1 mol·L-1的盐酸溶液2 mL，放置2 h，用1 mol·L-1的氢氧化钠溶液中和，加流动相稀释至刻度，摇匀，进样20 μL。结果见图3。

　　2.4.2 碱破坏 精密量取本品1 mL，置20 mL容量瓶中，加1 mol·L-1的氢氧化钠溶液2 mL，放置1 h，用1 mol·L-1的盐酸溶液中和，加流动相稀释至刻度，摇匀，进样20 μL。结果见图3。

　　2.4.3 氧化破坏 精密量取本品1 mL，置20 mL容量瓶中，加质量分数30% h3O2 3滴，放置1 h，加流动相稀释至刻度，摇匀，进样20 μL。结果见图3。

　　2.4.4 光照破坏 精密量取本品1 mL，置20 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，置4 500 LX照度下放置24 h，进样20 μL。结果见图3。

　　由图可知，本品在强酸、光照条件下较稳定，氧化破坏产生杂质3，碱破坏产生杂质4。通过对左卡尼汀注射液主成分、降解产物进分离检测，分离度均符合要求，不干扰左卡尼汀含量及有关物质测定。

　　2.5 线性关系及范围

　　精密称取左卡尼汀对照品约500 mg，置50 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为储备液。精密量取此溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0 mL分别置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，照“2.2”项下测定，记录色谱图。以左卡尼汀峰面积(A)对其质量浓度(ρ，mg·mL-1)进行回归，得左卡尼汀回归方程为：ρ=15760+2.301×105A，r=0.999 9。结果表明左卡尼汀在1.037 6～8.301 1 mg·mL-1范围内与峰面积线性关系良好。

　　2.6 检测限的考察

　　精密称取左卡尼汀、杂质A各适量，逐步稀释制成浓度适宜的对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件，以信噪比S/N=3计算，测得左卡尼汀的检测限为3 ng，杂质A的检测限为0.02 ng。

　　2.7 精密度试验

　　取左卡尼汀对照品溶液20 μL，重复进样6次，其峰面积RSD值为0.11%。

　　2.8 回收试验

　　按处方量的80%、100%、120%精密称取左卡尼汀对照品各3份，分别加入处方量辅料，加流动相稀释制成左卡尼汀质量浓度分别为4、5、6 mg·mL-1的溶液，按照“2.2”项下方法测定，计算得平均回收率为100.7%，RSD值为1.4%(n=9)。

　　2.9 供试品溶液的稳定性考察

　　取供试品溶液，分别在室温放置0、1、2、4、6 h，分别进样20 μL，测得左卡尼汀峰面积RSD为1.3%;有关物质按“2.11”项有关物质方法进行测定，杂质A测定结果均为0.011%，其他杂质之和(除杂质A)的测定结果依次为0.91%、0.76%、0.77%、1.00%、0.99%，均值为0.87%。杂质个数、杂质量均未增加，表明溶液在6 h内稳定。

　　2.10 含量测定

　　取对照品溶液、供试品溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中左卡尼汀的含量。结果见表1。

　　2.11 有关物质的测定

　　精密移取本品适量，用流动相配制成每1 mL中含左卡尼汀5 mg的溶液，作为供试品溶液;精密量取供试品溶液1 mL至100 mL量瓶中，加流动相制成每1 mL中约含左卡尼汀50 μg的溶液，摇匀，作为对照溶液(a);精密称取杂质A对照品适量，加流动相制成每1 mL中约含杂质A 0.025 mg的溶液，作为对照品溶液(b)。取对照溶液(a) 20 μL注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分峰高度为记录仪满量程的20%～25%，再精密吸取供试品溶液、对照溶液(a)和对照品溶液(b)各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。供试品溶液如显杂质峰，除溶剂峰外，含杂质A的峰面积不能大于对照品溶液(b)的主峰面积(0.5%)，其他各杂质峰面积之和不得大于对照溶液(a)的3倍(3%)。结果见表1。表1 左卡尼汀注射液含量及有关物质测定结果

　　3 讨 论

　　3.1 本试验对流动相的pH值从4.0～5.0进行考察，发现pH=4.3时，左卡尼汀与杂质A的分离情况最好，故选用0.05 mol·L-1磷酸盐缓冲液乙腈(体积比35∶65)(磷酸调节pH至4.3)作为流动相。

　　3.2 由于左卡尼汀为末端吸收且吸收较弱，有关物质测定干扰多，故应保证配制溶液的玻璃仪器的洁净，流动相宜当天配置。

　　3.3 由于杂质A含有共轭双键，在205 nm处的紫外吸收比左卡尼汀强，因此，采用主成分自身对照法测得的杂质A含量远远大于外标法测得的真实含量。本公司样品中的杂质A按外标法计算含量约0.012%，按不加校正因子主成分自身对照法结果约1.63%;进口产品中杂质A按外标法计算含量为0.18%，按不加校正因子主成分自身对照法结果为24.9%。通过杂质A对照品和左卡尼汀对照品测得杂质A相对左卡尼汀响应因子为138.9，远远超出0.9～1.1范围，故不能采用不加校正因子主成分自身对照法计算。

参考文献

　　[1] 国家食品药品监督管理局.WS1-(X-085)-2005Z国家药品标准[S].

　　[2] 国家食品药品监督管理局.JX20060188国家药品标准[S].

　　[3] United States Pharmacopoeia Convention Inc.USP 31[S].2008:2516.

　　[4] The Quality of Medicines of the Council of Europe.EP6.0[S].2008:2257.

　　[5] British Pharmacopoeia Commission.BP 2007[S].2007：1339.