HPLC法测定盐酸异丙嗪注射液有关物质

　　　　　　 作者：宋新康　饶春意，姚海燕，梁香

【摘要】 目的 建立HPLC法测定盐酸异丙嗪注射液有关物质含量。方法 采用反相高效液相色谱法：色谱柱为SHIMADEU VpC18柱，甲醇水(用冰醋酸调节pH值为2.25±0.05)(体积比49∶51)为流动相，流速：0.8 mL·min-1，柱温：30 ℃，检测波长为254 nm。结果 在正常贮藏条件下，11批样品的杂质总量均在0.4%～0.6%之间，定量限小于0.5 μg。结论 本法可用于盐酸异丙嗪注射液中有关物质的含量测定。

【关键词】 高效液相色谱法;盐酸异丙嗪注射液;有关物质

Abstract:Objective To establish a HPLC method to determine related substance in promethazine hydrochloride injection. Method The HPLC was carried out on a C18 column，of which the mobile phase was consisted of water (adjusted to pH 2.25±0.05 by acetate) and methanol (51∶49). The detective wavelength was 254 nm. Results The contents of 11 samples were above 0.4%，and below 0.6% under normal store conditions. The limit of quantification was under 0.5 μg. Conclusion It is simple，accurate and feasible for determining related substance in promethazine hydrochloride injection by HPLC.

　　Key words:HPLC; promethazine hydrochloride injection; related substance

　 盐酸异丙嗪注射液为常用抗组胺药，本品以吩噻嗪为母核经缩合而成，在缩合反应时产生NN，β三甲基10H吩噻嗪10乙胺异构体，虽经丙酮精制等步骤，但仍难以完全除去，故成品中可能带入吩噻嗪及上述异构体等杂质。本品不稳定，在贮存过程中因光照或受热可分解[1]。1977年版中国药典用比色法检查吩噻嗪，1985年版改为薄层色谱法检测至今[2]，但薄层色谱法操作复杂、定量困难。本文采用HPLC法测定盐酸异丙嗪注射液中的有关物质，重现性好、灵敏度高、方法简便，可用作该制剂有关物质的含量测定。

　　1 仪器与试药

　　Agilent Technologies 1200sereir 型高效液相色谱仪，DE71361394检测器，SHIMADEU VpC18柱(250 mm×4.6 mm，5μm )(日本岛津)。

　　盐酸异丙嗪注射液(广东邦民制药有限公司，批号：070301;天津药业集团新郑股份有限公司，批号：0801082、0802182、0802181;广东南国药业有限公司，批号：080201;西南药业股份有限公司，批号：071204;北京市永康药业有限公司，批号：07090252、07090152、08020152;上海禾丰制药有限公司，批号：071106、070901)、盐酸异丙嗪对照品(中国药品生物制品检定所，批号：100422200501)、甲醇(色谱纯，天津四友生物医学技术有限公司)，维生素C对照品(中国药品生物制品检定所，批号100425200301)，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

　　2 方法与结果

　　2.1 溶液的制备

　　2.1.1 盐酸异丙嗪对照品溶液的制备 取盐酸异丙嗪对照品适量，精密称定，加入0.1 mol·L-1盐酸溶液稀释成每1 mL中含盐酸异丙嗪0.02 mg的溶液，即得。

　　2.1.2 样品溶液的制备 精密量取本品2 mL(约相当于盐酸异丙嗪50 mg)，置250 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1盐酸溶液稀释制成每1 mL中含盐酸异丙嗪0.2 mg的溶液，作为供试品溶液[2，3];精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

　　2.1.3 阴性溶液的制备 按处方量称取除盐酸异丙嗪外的辅料，加水制成阴性溶液。

　　2.1.4 维生素C对照品溶液的制备 取维生素C对照品，精密称定，加0.1 mol·L-1盐酸溶液稀释制成每1 mL中含0.02 mg的溶液，作为维生素C对照品溶液。

　　2.2 色谱条件与系统适用性实验

　　色谱柱：SHIMADEU VpC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：甲醇水(用冰醋酸调节pH值为2.25±0.05)(体积比49∶51)，流速：0.8 mL·min-1，柱温30 ℃，检测波长[2]：254 nm，进样量：20 μL。取“2.1”项下各溶液分别进样测定，色谱图结果见图1。从图中可见，主峰保留时间为8 min左右，理论塔板数不小于3 300，主峰与相邻杂质峰的分离度大于2.0。

　　2.3 专属性试验

　　根据盐酸异丙嗪的稳定性及《中国药典》2005年版附录《药品质量标准分析方法验证指导原则》要求，对广东邦民制药有限公司样品(批号：070301)、辅料进行强制降解试验(加速破坏试验)，以验证分析方法对相关降解产物检查的专属性。

　　2.3.1 氧化破坏试验 精密量取样品、阴性溶液各2 mL，分别置250 mL量瓶中，加质量分数30%的过氧化氢溶液2 mL，再加0.1 mol·L-1 盐酸溶液稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取20 μL进样，记录色谱图(见图2A)。

　　2.3.2 高温破坏试验 精密量取样品、阴性溶液各2 mL，分别置250 mL量瓶中，置80 ℃恒温水浴锅中水浴加热40 min后，加0.1 mol·L-1盐酸溶液稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取20 μL进样，记录色谱图。见图2B。

　　2.3.3 酸破坏试验 精密量取样品、阴性溶液各2 mL，分别置250 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1 硫酸溶液 2 mL，摇匀，放置30 min，加0.1 mol·L-1盐酸溶液稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取20 μL进样，记录色谱图(见图2C)。

　　2.3.4 碱破坏试验 精密量取样品、阴性溶液各2 mL，分别置250 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液2 mL，摇匀，放置30 min，加0.1 mol·L-1盐酸溶液稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取20 μL进样，记录色谱图(见图2D)。

　　2.3.5 光照破坏试验 精密量取样品、阴性溶液各2 mL，分别置250 mL量瓶中，置1 500 LX光照度的日光灯下光照72 h后，加0.1 mol·L-1盐酸稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取20 μL进样，记录色谱图(见图2E)。

　　2.3.6 专属性试验结果分析 根据专属性试验色谱图进行分析，阴性溶液在平行试验中对有关物质的测定不产生干扰，且各杂质峰分离度均符合规定。样品在酸、碱条件下较为稳定，经高温、氧化、光照破坏后杂质数分别增加11、7和7个，总杂质峰面积分别增大566、254、1 208 mAU。光照破坏样品图谱在8.7、10.4 min杂质峰面积分别增大7.4倍和49.1倍。通过样品溶液与阴性溶液图谱比较可知，杂质由盐酸异丙嗪分解产生。

　　2.4 稳定性与精密度试验

　　2.4.1 稳定性试验 取本品(批号070301)适量，配制成20 μg·mL-1溶液，于0、1、2、3、4、5、6、7 h分别进样。 结果杂质峰个数及峰面积保持不变， 杂质峰面积RSD值为0.6%，表明其在7 h内稳定。

　　2.4.2 重复性试验 精密量取本品(批号070301)2.0 mL，共9份，分别置250 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1的盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取20 μL，进样。其杂质峰面积的RSD值为1.3%。

　　2.5 定量限

　　目前尚无盐酸异丙嗪有关杂质对照品，故采用本实验建立的方法与2005年版中国药典二部薄层色谱法进行对比。原方法定量限为0.5 μg[3]，对于原方法检测无杂质斑点的样品，用本文方法检出杂质总量为0.3%，故可认定本文方法的定量限小于0.5 μg，符合检测要求。

　　2.6 测定法

　　精密吸取“2.1.2”项下对照溶液20 μL注入液相色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20%。精密吸取供试品溶液、对照溶液、维生素C对照品溶液各20 μL，分别进样，记录色谱图至主峰保留时间的3倍(见图1)。在保留时间约3.4 min时出现1个较大色谱峰，而片剂在使用该法测定时无此峰。经证明该色谱峰为辅料维生素C，故采用维生素C对照品进行定位，最后从杂质峰中扣除该色谱峰面积的方法进行测定。用面积归一化法计算各杂质峰面积总和不得大于对照溶液主峰面积。

　　2.7 样品有关物质测定结果

　　依法对6个厂家11批样品进行有关物质测定，见表1。

　　根据2005年版中国药典二部的规定[1]：盐酸异丙嗪注射液杂质总含量不得超过2.5%。由表1可见，在正常贮藏条件下，11批样品的杂质总量均在0.4%～0.6%之间，因此将本制剂有关物质总量控制在2.0%内。表1 盐酸异丙嗪注射液有关物质的测定结果

　　3 讨 论

　　3.1 色谱柱的选择

　　参考USP30版，用苯基柱进行测定，经反复试验，其色谱峰对称性差，适应范围小。查阅大量文献并经过多次实验，以C18柱分离效果最好，且其在中国药典中使用普遍，故采用C18柱。

　　3.2 流动相的选择

　　在文献报道中，有人采用0.5%三乙胺溶液(用磷酸调pH至2.5)乙腈(体积比65∶35)[4]、(0.02 mol/L磷酸二氢钾缓冲液)乙腈甲醇(体积比60∶17∶23)为流动相[5]或乙腈0.023 mol·L-1磷酸盐作流动相[6，7]。本文从保护环境与色谱柱的角度出发，并结合盐酸异丙嗪在酸性条件下稳定性较好的性质，选用甲醇水(用冰醋酸调节pH值为2.25±0.05)(体积比49∶51)作为流动相，减少了毒性较大的乙腈及对柱保护不利的盐类物质的使用。

　　3.3 溶剂的选择

　　在片剂含量测定考察中，曾采用水作为稀释溶剂，但其含量测定结果与2005年版中国药典所使用紫外方法测定的结果比较，数值明显偏低，故选用0.1 mol·L-1的盐酸溶液作为溶剂。为统一2种制剂的检测方法，将注射剂稀释溶剂亦改为0.1 mol·L-1的盐酸溶液。

　　本实验在盐酸异丙嗪注射液和片剂含量测定研究的基础上，同时研究起草有关物质测定方法。该法避免了2005年版中国药典使用薄层色谱法测定所造成的人为判断结果的误差，且方法简便、稳定、检测限低，可作为该药品有关物质的检测方法。

参考文献

　[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2005年版二部[M].北京：化学工业出版社，2005:512.

　　[2] United States Pharmacopoeia Convention Inc. USP 30:[M].2008:3037-3038.

　　[3] 卫生部药典委员会.中华人民共和国药典：1990年版二部药典注释[M].北京：化学工业出版社，1996:595.

　　[4] 彭芳玲，阳利龙，龙荣，等.HPLC测定盐酸异丙嗪糖浆中盐酸异丙嗪的含量[J].儿科药学杂志，2008，14(2):43-44.

　　[5] 宋霞林，谌官和. HPLC测定盐酸异丙嗪糖浆中盐酸异丙嗪含量[J].中国现代应用药学，2008，25(3):57-58.

　　[6] 罗西湘，杜兴，贺军权，等.HPLC同时测定胆龙止喘片中氨茶碱和盐酸异丙嗪两组分的含量[J].中成药，2008，30(7):75-78.

　　[7] 梁改玲，王雪芹，仲平.高效液相色谱法测定异丙嗪胆汁片中盐酸异丙嗪的含量[J].药物分析杂志，2005，25(9):139-141.