肺癌患者痰细胞特征参数的分析及其临床意义

【摘要】 目的 由于DNAIndex(DI)的定量细胞学诊断系统对于DI值在1～2.5增生细胞性状诊断的不足，探讨是否存在恶性变化倾向，并寻找能区分恶性变化的特征参数作为临床早期诊断的指标。方法 肺癌组10名，10名肺结核患者为非癌组。取两组患者清晨自咳痰经液基薄层制片和FeulgenThinion染色，应用全自动细胞图像分析系统进行DNA定量分析。肺癌组每例在DI=1.0，1.5，2.0，2.5处各取10个细胞，非癌组每例在DI=1.0，1.5，2.0处各取10个细胞。对核面积(Area)、核半径变异(Varradius)、 形状(Sphericity)、 核边界变化(Harmono3fft)、低密度染色质在核面积中所占百分比(LowDNAarea)、中密度染色质在核面积中所占百分比(MedDNAarea)和高密度染色质在核面积中所占百分比(HiDNAarea)等参数进行统计分析。结果 在G0/G1期(DI=1.0)，癌组与非癌组相比，各参数之间差异无显著性(P>0.05)。在S期(DI=1.5)，HiDNAarea能显著区分肺癌组增生细胞的恶变(P<0.01)。HiDNAarea、MedDNAarea和Harmono3fft 3个参数不仅能显著区分癌组高异倍体细胞(DI=2.5)(P<0.01)，还能显著区分G2/M期癌组高度增生细胞(DI=2.0)的恶变(P<0.01)。Area和LowDNAarea能识别痰中癌组高异倍体细胞(DI=2.5)的特征变化(P<0.01)，而Var radius和Sphericity不能识别痰中癌组高异倍体细胞(DI=2.5)的特征变化。结论 依据HiDNAarea ，MedDNAarea 和核边界变化(Harmono3fft)等参数，提高对DI在1～2.5之间增生细胞发生恶性变化的诊断。

【关键词】 肺癌;痰细胞;全自动细胞图像分析系统;核特征

Abstract:Objective Automated image cytometry could not accurately recognize malignant changes of plastic cells (DI=1-2.5) through DNAIndex (DI). The aim of the study was to determine the presence of malignant changes of these plastic cells (DI=1-2.5) in sputum specimens from patients with lung cancer and to find some nuclear features to recognize them. Methods Sputum cells from ten patients with lung cancer and ten tuberculous patients were used in the study. Automated image cytometry was performed on FeulgenThionin stained sputum of patients with lung cancer or with tuberculosis. In cancer group，ten cells were selected respectively in the range of DNAIndex (DI=1.0，1.5，2.0，2.5) for each patient. In noncancer group，ten cells were selected respectively in the range of DNAIndex (DI=1.0，1.5，2.0) for each patient. The seven nuclear features were separately compared between the two groups. Results The seven nuclear features were not significant different between the lung cancer group and noncancer group during G0/G1 phase (DI=1.0). In S phase (DI=1.5)， the malignant proliferating cells in the cancer groupcould be distinguished by HiDNAarea(P<0.01). Hyperplastic cells (DI=2.0) in the cancer group and malignancy of hyperplastic cells (DI=2.0) in G2/M phase could be distinguished by the three parameters of HiDNAarea，MedDNAarea，and Harmono3fft with P<0.01. Hyperplastic cells (DI=2.5) in sputum from the cancer group could be distinguished by LowDNAarea，while the changes of nuclear features of hyperplastic cells (DI=2.5) from the cancer group could not be distinguished by varradius and sphericity. Conclusion The diagnosis of malignancy of plastic cells (DI=1～2.5) could be improved based on parameters including HiDNAarea，MedDNAarea，and Harmono3fft.

　　Key words:lung cancer，automated image cytometry，sputum，nuclear features

　　肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤，是一种严重威胁人民健康和生命的疾病，5年平均生存率20%以下[1] 。常规痰细胞学在过去30年里长期用于肺癌早期普查和诊断，与CT和支气管内镜检查相比，痰脱落细胞学检查简单易行、费用低、无损伤，但敏感性较低[2，3]，改善相关技术引起了人们的重视。

　　全自动细胞图像分析系统可以应用细胞核的亮度、色彩、纹理、轮廓形态等参数精确描述细胞核内DNA倍体和外部形态特征，能准确反映肺癌患者痰液中的癌细胞或癌前病变产生的非典型细胞的细胞学改变。这种定量细胞学的检测方法较传统的光学显微镜观察更准确，通过具体的细微特征参数对病情进行诊断，提高准确性[4-6]。

　　目前，全自动细胞图像分析系统作为一种新的定量病理分析技术，在乳腺癌、子宫颈癌等肿癌诊断研究方面取得一定进展，但在肺癌患者痰细胞学方面，还没有广泛应用[7]。而DNAIndes(DI)在1.0～2.5之间的增生细胞性状还不能诊断。有文献报道[8]，某些重度增生细胞恶变癌细胞的比例很高，如能有效地对这些增生细胞进行有效的诊断，将提高早期诊断的敏感性。因此，本研究根据肿瘤细胞与正常细胞在大小、形状、核边界和染色体质地等方面的差异，重点考察描述核面积、半径变异、形状、核边界和低密度染色质在核面积中所占百分比、中密度染色质在核面积中所占百分比和高密度染色质在核面积中所占百分比等7种参数来考察肺癌患者痰中DI在1.0～2.5之间增生细胞性状的特征变化及其临床意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 一般资料

　　肺癌组患者10名，来自2003年4月～2003年8月武汉大学人民医院和华中科技大学同济医院胸外科术前病人，其痰样本经过全自动细胞图像分析系统检测有DI>2.5的细胞出现，并经术后病理学证实为肺癌，其中男7名，女3名，平均年龄65.3岁。非癌组患者10名，为肺结核患者，来自武汉市结核病医院，均无恶性肿瘤并发症，其中男9名，女1名，平均年龄43.5岁。

　　1.2 痰样本采集

　　所有痰样本均在医生指导下获取术前清晨自咳痰， 置于盛有SedFix固定液的50 mL痰管中保存，

　　1～3 d内送武汉市兰丁早期肺癌诊断中心检测。

　　1.3 样本处理

　　在每份癌管中加30 mL 0.1%DTT(Sigma公司)于痰样本中，振荡，离心，配制1 mL 50%甲醇中含3.7 μL的细胞重悬液涂片，制2张薄层细胞片，经FeulgenThionin染色[9]进行DNA定量分析。

　　1.4 全自动细胞图像分析系统分析[5]

　　全自动细胞图像分析系统(cytosavant，oncometrics imaging corporation，Vancouver)由加拿大哥伦比亚BC省肿瘤研究所研制，是一个能定量检测脱落细胞DNA结构和含量的系统。

　　标本细胞片贴上能被系统自动识别的条形码后，将细胞片固定在Olympus BH2显微镜(Nikon 20 Plan Apo物镜)上，同时用一个高分辨率的数码相机(Xillix Microlmager 1400)进行扫描。滤色镜波长范围为(600±10) nm，与染色后细胞核的峰吸收度光谱范围相符。系统的空间分辨率为0.34 μm×0.34 μm。单个细胞核的捕捉可由一个独特的片段聚焦系统自动完成，即在预编细胞捕捉程序的控制下，切片可在目镜下方自动移动来捕捉细胞。将每个细胞片用全自动方式聚焦测定， 以搜集将近5 000细胞核和非典型细胞核。

　　系统能捕捉高空间分辨率、高光度分辨率细胞的图像，所获取的细胞包含123种细胞特征参数。在计算程序FB6参数计算器帮助下，123种描述细胞核形态、亮度、色彩和纹理等参数被计算[10]。

　　本研究重点考察核面积(Area)、核半径变异(Varradius)、 形状 (Sphericity)、核边界变化(Harmono3fft)、低密度染色质在核面积中所占百分比(LowDNAarea)、中密度染色质在核面积中所占百分比(MedDNAarea)和高密度染色质在核面积中所占百分比(HiDNAarea)等7个参数。

　　1.5 统计方法

　　癌组每例在DI=1.0(0.9～1.1)，1.5(1.3～1.7)，2.0(1.8～2.2)，2.5(2.3～2.7)处各取10个细胞，非癌组每例在DI=1.0(0.9～1.1)，1.5(1.3～1.7)，2.0(1.8～2.2)处各取10个细胞，计算每组各参数平均变异。组间比较采用U检验。

　　2 结果

　　2.1 肺癌组与非癌组在DI=1.0细胞相关参数的比较

　　在DI=1.0(G0/G1)，肺癌组的二倍体细胞与非癌组二倍体细胞在上述特征参数中没有明显差异(P>0.05)，结果见表1。

　　2.2 肺癌组与非癌组在DI=1.5细胞相关参数的比较。

　　肺癌组与非癌组在DI=1.5(S期)处，肺癌组HiDNAarea与非癌组HiDNAarea差异有显著性(P<0.01)。而Area、Varradius、Sphericity、Harmono3fft、MedDNAarea和LowDNAarea等特征参数变化无统计学差异(P>0.05)，见表2。

　　2.3 肺癌组与非肺癌组在DI=2.0(G2/M期)细胞相关参数的比较

　　在DI=2.0(G2/M)，肺癌组与非癌组相比，Harmono3fft 、HiDNAarea和MedDNAarea 3参数差异有显著性(P<0.01)。而在Area、Varradius、Sphericity和LowDNAarea等特征参数变化无统计学差异(P>0.05)，见表3。

　　2.4 肺癌组DI=2.5细胞与非癌组DI=1.0，1.5，2.0细胞相关参数的比较

　　从图1-5可知， 肺癌组DI=2.5细胞与非癌组DI=1.0，1.5，2.0细胞Area、Harmono3fft、LowDNAarea、MedDNAarea和HiDNAarea差异均有显著性。表1 肺癌组与非癌组在DI=1.0细胞相关参数的比较肺癌组与非癌组相比：P>0.05表2 肺癌组与非癌组在DI=1.5细胞相关参数的比较表3 肺癌组与非癌组在DI=2.0细胞相关参数的比较

　　3 讨论

　　早期诊断是检测早期阶段(0期或1期)细胞核损伤，常规痰细胞学和X光技术无法检测细胞核的微损伤。MAC(malignancy associated changes)是肺癌早期诊断中非常有用的标志物，特别是在癌细胞学诊断中癌样中无可诊断癌细胞。应用图像分析系统检测痰样本MAC，提高痰细胞学的敏感性达80%，而常规痰细胞学敏感性一般为20%～40%[6]。

　　恶性肿瘤细胞的核异常改变与染色体呈非整倍体密切相关，染色体非整倍体，即DNA异倍体的出现是诊断肿瘤的客观标志物[11]，应用于肿瘤的诊断。正常情况下，大多数细胞处于G0/G1期，其核内DI=1为二倍体细胞，少数进入DNA合成后期及有丝分裂期(G2/M)，DI=2(四倍体细胞)。在二倍体与四倍体之间(S期)只有少数异倍体细胞，如检测DI>2.5的DNA非整倍体细胞，表明有恶性肿瘤细胞存在的可能[12]。然而，DNA非整倍体未出现也不排除有肿瘤形成或恶化的可能。全自动细胞图像分析系统应用于痰检也存在一定的假阴性的情况，其敏感性、特异性受某些因素的影响。生理因素，如多倍体的出现;非生理因素，如基因改变、病毒感染，这些因素均有可能改变DNA的结构，影响结果。结果的假阴性也与病人痰样并非来自肺深部有重要的关系，但是由于痰液中的肿瘤细胞较少，较易破坏变形，以及混杂大量的炎性细胞及上皮细胞，所以常规的痰涂片供诊断的细胞少，敏感性不高，存在假阴性的情况[9]。

　　因此，为了提高对肺癌痰细胞诊断的敏感性，本研究不仅考察了在DI=1.0(G0/G1)肺癌患者是否存在MAC，而且也考察了肺癌者痰细胞在DI=1～2.5是否存在恶性变化。

　　本研究表明，在DI=1.0(G0/G1)期间，癌组与非癌组细胞相比，在面积、半径变异、核边界变化、核的形状、低密度染色质在核面积中所占百分比、中密度染色质在核面积中所占百分比和高密度染色质在核面积中所占百分比等7个参数均无明显差异(P>0.05)。

　　在DI=1.5(S期)，癌组与非癌组相比，高密度染色质在核面积中所占百分比明显升高(P<0.01)，染色体质地开始变得致密。癌组细胞在S期开始呈现恶性变化，提示HiDNAarea可识别细胞在S期的恶性变化。

　　在DI=2.0(G2/M期)，癌组细胞与非癌组细胞相比，中密度染色质在核面积中所占百分比明显降低(P<0.01)，高密度染色质在核面积中所占百分比明显提高(P<0.01)，核边界变化明显，核的染色体质地更加致密，细胞恶性变化加深。

　　在DI=2.5癌组高异倍体细胞与非癌组DI=1.0，1.5，2.0细胞相比，癌组细胞核面积明显变大，核边界变化明显，高密度染色质在核面积中所占百分比明显提高，中密度染色质和低密度染色质在核面积中所占百分比均明显下降，均可反映癌细胞恶性变化，提示这些参数是区分癌与非癌的重要特征。而核的半径变化、形状方面无明显差异。

　　总之，HiDNAarea可定量反映细胞在S期间的恶性变化;Harmono3fft，HiDNAarea、MedDNAarea可反映细胞在G2/M期的恶性变化，同时也可反映高异倍体癌细胞的特征变化。提示在全自动细胞图像分析系统应用于肺癌早期诊断或无DI>2.5的癌细胞出现的情况下，除了考虑DNAIndex指标外，还应参考HiDNAarea，MedDNAarea和Harmono3fft等参数，提高对DI在1～2.5之间增生细胞发生恶性变化的诊断，为临床早期诊断提供了客观的、可重复的指标，有利于提高其检测的敏感性。

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