紫色非硫细菌GP7基因文库的构建和新酯酶基因的克隆

　　　　　　作者：吴培诚，金小宝，张云光，王卓娅

【摘要】 目的 筛选并克隆具备降解甲氰菊酯农药的新酯酶基因。方法 通过建立紫色非硫细菌GP7的基因文库，用酯酶快速筛选方法获取甲氰菊酯降解基因。结果 从紫色非硫细菌GP7的基因文库中筛选到一个新型酯酶基因序列Rhe8。该基因核苷酸序列大小为810 bp，包含 269 个氨基酸残基，其中有 565 bp 序列片段与Rhodospirillum centenum SW 基因组的酯酶基因片段有 94% 的同源性。结论 通过初步测定，该酯酶具备降解甲氰菊酯的能力。

【关键词】 紫色非硫细菌;酯酶;甲氰菊酯;基因文库

Abstract:Objective To screen and clone a novel esterase gene with degradation activity of fenpropathrin. Methods To build a gene library of Rhodoplanes sp. GP7 and them screen the esterase gene with fenpropathrin degradation activity by the quick screening method. Results A novel esterase gene Rhe8 was screened from the gene library of Rhodoplanes sp. GP7. The gene sequence length was 810 bp including 269 aa residues，and 565bp sequence segment had 94% homology between the esterase gene segment of genome of Rhodospirillum centenum SW. Conclusions The preliminary testing showed that the esterase has the degrading activity to the fenpropathrin.

　　Key words:Rhodoplanes sp.; esterase; fenpropathrin; gene library

　　甲氰菊酯是拟除虫菊酯的一类，作为第三代杀虫剂被认为是一类安全有效的拟除虫菊酯。自20世纪80年代后被广泛应用于粮食、蔬菜和果树等多种农作物的广谱杀虫剂，但其长期广泛的使用，对土壤、大气和水源等造成了不同程度的污染[1]。其对健康的危害也不容忽视，主要包括对免疫系统的胁迫，对淋巴结和脾脏的损伤、致癌以及环境激素效应等[2]。寻找一种有效方法消除或降低食品和环境中的菊酯农药残留已成为当前迫切需要解决的问题。

　　在过去的研究工作中，本实验室获得了一株对菊酯类农药尤其是甲氰菊酯具备降解能力的菌株GP7，经鉴定属于紫色非硫细菌的红游动菌属(Rhodoplanes)[3]，鉴于直接应用农药降解酶制剂比应用产酶的菌剂更有优势[4]，为了能够产业化生产菊酯农药降解酶，本研究通过构建基因文库的方式，获得了新的具备降解甲氰菊酯的酯酶基因，并进行了相应的生物信息学分析，为高效基因工程菌的构建打下基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 菌株和质粒

　　紫色非硫细菌GP7(Rhodoplanes sp. GP7)为本实验保存，大肠杆菌感受态细胞DH5α为Tiangen公司产品。

　　1.2 试剂和仪器

　　各种酶制剂、dNTP及试剂盒等购自Tiangen公司;酯酶显色剂Xcaprylate购自Sigma公司，用N，N二甲基甲酰胺 (DMF) 配成1 mg/mL，分装后4 ℃保存;40%甲氰菊酯乳油购自中山市石岐农药厂;99%甲氰菊酯标准品购自广州化学测试中心;其余试剂均为国产分析纯。

　　LRh32502Gb光照培养箱为宏泰医疗器械公司产品，台式离心机Hettich universal 320及Tgradient 296型PCR仪为Biometro公司产品，Gel Doc 2000凝胶成像系统美国伯乐公司产品。

　　1.3 培养基与培养条件

　　光合细菌(PSB)培养基：MS培养基添加0.15%酵母膏，参照文献[5]，在PSB培养基中添加一定浓度甲氰菊酯作为诱导培养基;固体培养基则添加1.5%琼脂粉。

　　培养条件：采用200 mL三角瓶光照培养，培养温度为34 ℃，光照强度设定为3 000 lx。

　　1.4 基因文库的构建

　　使用诱导培养基光照培养GP7 3 d后，离心收集菌体。使用总DNA提取试剂盒按照试剂盒说明书提取其基因组总DNA，琼脂糖电泳初步检验纯度及浓度;使用Hind Ⅲ对基因组进行不完全酶切，回收其3～6 kb酶切片段，然后与已用Hind Ⅲ酶切并经牛小肠碱性磷酸酶处理过的pUC18质粒载体链接，转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α内，通过添加Amp抗生素的LB培养基初步筛选白色的转化子。

　　1.5 产酶基因克隆的快速测定

　　将1.4节筛选到的转化子用无菌牙签转移到含相应抗生素的LB平板上，对其编号。37 ℃培养18 h后，用含1 mg/mL Xcaprylate 的酯酶显色剂递加到菌落上。正置培养基2 h后观察菌体生成蓝色水解圈的情况。挑取带明显蓝色水解圈的菌落待测。

　　1.6 甲氰菊酯降解的效率测定

　　甲氰菊酯含量及降解效率参照文献[6]的方法进行。

　　1.7 基因测序和酯酶基因ORF同源性比较

　　将阳性转化子交由广州英伟创津公司测序。根据测序结果将序列递交到NCBI Genbank上，用NCBI上的软件工具ORF finder分析阳性克隆子质粒DNA克隆片段序列，进而推测其ORF与相应种属的同源性。

　　1.8 酯酶三级结构活性中心预测

　　登陆NCBI网站上的rpsBlast (reverse position specific BLAST) 对Phe8的保守区域进行查询，并使用NCBI所提供的三维结构分析软件Cn3D4.1，对酯酶的活性中心进行预测。

　　2 结果和分析

　　2.1 GP7总DNA的提取和纯化

　　将GP7菌种活化后接种到300 mL三角瓶光照培养后，离心收集菌体。按照总DNA提取试剂盒程序说明提取其基因组总DNA，重溶于50 μL TE中。用琼脂糖电泳观察浓度及纯度(见图1)。

　　2.2 GP7总DNA的部分酶切及质粒载体的预处理

　　用Hind Ⅲ对基因组进行不完全酶切，将酶切产物琼脂糖电泳后，回收其3～9 kb片段。同时用Hind Ⅲ对克隆载体pUC18质粒进行完全酶切，用牛小肠碱性磷酸酶处理后，胶回收备用(图1)。

　　将GP7总DNA Hind Ⅲ不完全酶切产物与经同样酶切的pUC18质粒用T4连接酶4 ℃连接16 h后，转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，经预培养后涂布到含Amp和Xgal的LB平板上，37 ℃培养18 h后，筛选白色转化子。