HPLC法测定石杉碱甲缓释片中石杉碱甲的含量

【摘要】 目的 测定石杉碱甲亲水凝胶骨架缓释片中石杉碱甲的含量。方法 采用高效液相色谱法，Kromasil C18柱，甲醇-0.02%三乙醇胺溶液(体积比60∶40)为流动相，检测波长为309 nm，流速为1.0 mL·min-1，柱温为30 ℃，进样量20 μL。结果 石杉碱甲在1.041～52.05 μg·mL-1范围内有良好的线性关系，r=0.999 6。平均回收率为99.37%，RSD=0.40%。结论 本方法简便、准确、专属性强，可用于该制剂的质量控制。

【关键词】 石杉碱甲;亲水凝胶骨架缓释片;高效液相色谱法;含量测定

Abstract:Objective To establish a method for the determination of huperzine A in huperzine A hydrophilic matrix sustainedrelease tablets.Methods HPLC was performed on a C18 column using mathanol0.02%triethanolamine (60∶40) as the mobile phase at a flow rate of 1 mL·min-1. The detection wavelength was at 309nm. The column temperature was 30 ℃ and the sample size was 20 μL.Results The linear range of huperzine A was 1.041 ～52.05 μg·mL-1 (r=0.999 6)， the average recovery was 99.37%(RSD=0.40%).Conclusions The method is simple， accurate， special and can be used for the quality control of huperzine A hydrophilic matrix sustainedrelease tablets.

　　Key words:huperzine A; hydrophilic matrix sustainedrelease tablets; HPLC; content determination

　　 石杉碱甲是从石杉科植物蛇足石杉中分离出的生物碱之一，为强效可逆性胆碱酯酶抑制剂。动物实验表明，石杉碱甲有增强小鼠学习、记忆能力等作用[1]。经临床证明，其对重症肌无力和老年性健忘症、痴呆症具有确切疗效[2]，其治疗老年痴呆病的机理可能是通过改变人体中的超氧化物歧化酶和过氧化脂质而发挥作用[3]。目前石杉碱甲常用剂型为片剂、注射液。由于石杉碱甲生物半衰期短，临床需每日给药3～4次，给医生与患者带来诸多不便。本院采用羟丙甲纤维素研制的石杉碱甲亲水凝胶骨架缓释片(以下简称石杉碱甲缓释片)，24 h只需服用1次，可减少服药次数，降低不良反应，提高患者依从性。本研究采用HPLC法测定石杉碱甲缓释片中石杉碱甲的含量，方法简便、灵敏、专属性强，结果准确可靠，可为本品质量控制和体外释放度考察提供基础。

　　1 仪器与试药

　　Waters26952996型高效液相色谱仪(美国Waters公司)。石杉碱甲对照品(中国药品生物制品检定所，批号：100243200401);石杉碱甲缓释片(自制，规格：0.3 mg·片-1，批号：090901、090902、090903);甲醇、乙腈(色谱纯，美国迪马公司);其他试剂均为分析纯。

　　2 方法与结果

　　2.1 样品液制备

　　2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取石杉碱甲对照品10.41 mg，置100 mL棕色量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，得到0.1041 mg·mL-1的石杉碱甲对照品贮备液。再精密吸取贮备液3 mL置10 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，即得。

　2.1.2 供试品溶液的制备 取石杉碱甲缓释片20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于石杉碱甲0.3 mg)，置10 mL量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜过滤，即得。

　　2.1.3 阴性对照液的制备 取处方比例辅料，按石杉碱甲缓释片制备工艺制得空白缓释片，再按“2.1.2”项下制备方法制备，即得。

　　2.2 色谱条件及系统适应性试验

　　色谱柱：Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5μm)色谱柱;流动相：甲醇0.02%三乙醇胺溶液(体积比60∶40);流速：1 mL·min-1;检测波长：309 nm;柱温：30 ℃;进样量：20 μL。分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照液注入色谱仪，在此条件下，理论板数以石杉碱甲峰计应不低于2 000，石杉碱甲与其他组分可基线分离，阴性样品不干扰测定。见图1。

　　　2.3 方法学考察

　　2.3.1 线性关系考察 分别吸取一定量的石杉碱甲对照品贮备液，加流动相稀释成石杉碱甲质量浓度为1.041、2.082、3.123、5.205、10.41、52.05 μg·mL-1的溶液，依次进样20 μL，每个浓度测定3次以上。以石杉碱甲对照品溶液质量浓度(ρ)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，进行线性回归，得回归方程：A=31940ρ-210.08，r=0.999 6。结果表明石杉碱甲质量浓度在1.041～52.05 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。

　　2.3.2 精密度试验 取供试品溶液(批号090901)20 μL 连续测定6次，其峰面积RSD=1.2%，表明仪器精密度良好。

　　2.3.3 稳定性试验 取供试品溶液(批号090901)在0、2、4、8、12、16、24 h分别进样20 μL，结果峰面积的RSD=1.1%(n=7)， 表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

　　2.3.4 重复性试验 取同一批号(批号090902)样品6份，每份约相当于石杉碱甲0.3 mg，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备并测定，记录峰面积，RSD=0.7%。

　　2.3.5 加样回收试验 精密称取同一批号石杉碱甲缓释片(090903)粉末适量(约相当于石杉碱甲0.15 mg)，分别置10 mL量瓶中，再分别加入石杉碱甲对照品贮备液1.5 mL，加流动相适量，超声使溶解并定容至刻度，摇匀，滤过，按“2.2”项下色谱条件测定，计算回收率，结果见表1。石杉碱甲平均回收率为99.37%，RSD是0.40%。

　　2.4 样品测定

　　取石杉碱甲缓释片3批，按“2.1.2”方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，计算样品中石杉碱甲含量，结果表明石杉碱甲缓释片的平均含量是标示量的99.5%，RSD为1.4%。表1 回收率试验结果

　　3 讨论

　　本文先后比较了甲醇0.02%三乙醇胺溶液、乙腈0.02%三乙醇胺溶液及不同浓度的三乙醇胺溶液作为流动相的分离效果，结果表明，以甲醇0.02%三乙醇胺溶液(体积比60∶40)作为流动相，所得峰形较好，主峰、杂质峰能达到基线分离，可获得较高的理论塔板数、分离度，拖尾因子(1.035)达到要求。本研究确定的含量测定方法简便准确、专属性强，为本品质量控制和体外释放度考察提供基础。

参考文献

　[1] FILLIAT P， FOGUIN A， LALLEMENT G. Effects of chronic administration of huperzine A on memory in guinea pigs[J].Drug Chem Toxicol，2002，25(1):9-24.

　　[2] 张振馨，王新德，陈清棠，等.石杉碱甲治疗阿尔茨海默病的有效性和安全性的多中心双盲随机对照试验[J].中华医学杂志，2002，82(14)：941.

　　[3] 张新卿，丁铭臣，孟琛，等.口服石杉碱甲改善记忆障碍的临床研究[J].中国新药杂志，1996，5(1)：33-34.