虫草素对肿瘤坏死因子α诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖及syndecan4蛋白表达的影响

　　　　　　作者：张宇，欧阳平，赖文岩，贝伟剑2，许顶立

【摘要】 目的 观察虫草素对肿瘤坏死因子α(TNFα)刺激的离体大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和syndecan4蛋白表达的影响。 方法 体外培养大鼠胸主动脉VSMCs，分别应用终浓度为20 ng/mL TNFα、20 μmol/mL虫草素、40 μmol/mL虫草素、20 ng/mL TNFα+20 μmol/mL虫草素、20 ng/mL TNFα+40 μmol/mL虫草素作用24 h，并设对照组进行比较。采用MTS/PMS法确定VSMCs的增殖状态，利用Western blot蛋白免疫印迹法测定VSMCs中syndecan4蛋白的表达。结果 (1)与对照组比较，TNFα组能显著刺激大鼠VSMCs的增殖(P<0.05)，而虫草素不同剂量组单独应用对大鼠VSMCs的增殖均无明显作用(P>0.05)。TNFα联合虫草素共同作用组与TNFα组比较， VSMCs增殖均显著减少(P<0.05)。(2)Western blot蛋白免疫印迹法测定显示：与对照组比较，TNFα组能显著刺激VSMCs的syndecan4蛋白表达(P<0.05)，而虫草素不同剂量组单独应用对VSMCs的syndecan4蛋白表达均无明显影响(P>0.05)。TNFα联合虫草素共同作用组与TNFα组比较，VSMCs的syndecan4蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论 虫草素可明显抑制TNFα诱导的VSMCs 增殖及细胞syndecan4蛋白的表达。

【关键词】 syndecan4;虫草素;肿瘤坏死因子α;血管平滑肌细胞;细胞增殖

Abstract:Objective To investigate the effects of cordycepin on the proliferation of rat vascular smooth muscle cells(VSMCs)and expression of syndecan4 protein induced by tumor necrosis factorα(TNFα).Methods VSMCs were cultured in vitro and exposed to 20 ng/mL TNFα，20 μmol/mL cordycepin，40 μmol/mL cordycepin，20 μmol/mL cordycepin with 20 ng/mL TNFα，and 40 μmol/mL cordycepin with 20 ng/mL TNFα，respectively. All groups were treated for 24 h in vitro，in addition to the control group established for comparison. The ratio of proliferation of VSMCs was determined by nonradioactive MTS/PMS assay and the expression of syndecan4 protein was evaluated by Western blotting using antisyndecan4 antibody.Results (1) Compared to the control group，TNFα significantly stimulated the proliferation of rat VSMCs at the concentration of 20 ng/mL in TNFα group (P<0.05). Cordycepin alone had no effect on VSMCs growth (P>0.05)，but significantly inhibited VSMCs proliferation induced by TNFα (P<0.05). (2) Compared to the control group，the expression of syndecan4 protein in VSMCs was significantly enhanced by TNFα at the concentration of 20 ng/ml (P<0.01). Cordycepin alone had no effect on the expression of syndecan4 protein (P>0.05)，but significantly inhibited the expression induced by TNFα (P<0.01).Conclusion Cordycepin could inhibit cell proliferation and expression of syndean4 protein in rat VSMCs induced by TNFα in vitro.

　　Key words:syndecan4; cordycepin; tumor necrosis factorα; vascular smooth muscle cells; cell proliferation

　　血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖和表型改变是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的主要病理基础之一，动脉粥样硬化是对血管损伤的过度炎症反应。肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factoralpha，TNFα)是炎症反应的关键调节因子之一，可从多种不同的炎症细胞中释放，在动脉粥样硬化发生发展中起着关键的作用。Syndecan4是硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)类的跨膜转运蛋白多糖syndecans家族的成员之一。Syndecan4主要在血管平滑肌细胞上表达，它作为一种与生长因子结合的共受体(coreceptor)，调控着多种细胞生物学效应，在细胞的伸展、识别、黏附、迁移和增殖控制中扮演着重要的角色，同时也介导炎症反应[1]。虫草素(cordycepin)即3’脱氧腺苷，为含氮配糖体的核酸衍生物，为冬虫夏草的主要药理活性成分之一。研究表明虫草素具有抗炎和免疫调节等作用[2]。本研究观察了虫草素对TNFα诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖及syndecan4蛋白表达的影响。

　1 材料与方法

　　1.1 主要材料

　　6周龄雄性SPF级SD大鼠，由南方医科大学实验动物中心提供(合格证号：SCXK粤20060015);DMEM培养基、0.25%胰酶均购自美国Gibco公司;胎牛血清(FBS)购自美国Hyclone公司;一次性96孔板购自美国Corning公司;TNFα购于美国Peprotech公司;虫草素购于美国Sigma公司(1108582002);CellTiter 96 Assay MTS/PMS试剂盒购于美国Promega公司(G5421);一抗为兔抗大鼠syndecan4多克隆抗体H140，购置于美国Santa Cruz公司(sc15350);二抗为羊抗兔IgG抗体，购置于英国Amersham公司(NA934);ECL化学发光试剂盒购于美国Pierce公司(JE120872);其余试剂均为国产分析纯。

　　1.2 VSMCs的原代培养

　　参考王道生贴块法[3]进行。取SD大鼠胸主动脉中膜，以贴块法培养于含10%(φ)胎牛血清的DMEM 培养基中，置于37 ℃、5%的CO2孵箱中培养。2～3周出现致密细胞层后即可传代，传代细胞呈典型的“峰与谷”样生长。细胞经使用抗αactin抗体鉴定为VSMCs，实验所用的VSMCs均为第3～6代传代细胞。

　　1.3 增殖评价

　　体外培养的SD大鼠VSMC在96孔板中以5 000个细胞/孔的密度铺板;8 h后，换成含1%FBS的DMEM培养基，维持48 h以获得同步的细胞生长停止;分别加入20 ng/mL TNFα、20 μmol/mL虫草素、40 μmol/mL虫草素、20 ng/mL TNFα+20 μmol/mL虫草素、20 ng/mL TNFα+40 μmol/mL虫草素。对照组为含5%FBS的DMEM培养基。24 h后细胞的增殖率通过应用96 Assay MTS/PMS试剂盒确定。用BioRad 550型Microplate Reader以490 nm波长测量吸光度(A)值，细胞的增殖率用A值表示。

　　1.4 Syndecan4蛋白免疫印迹测定

　　将体外培养的SD大鼠VSMCs分别用已配制好的试剂：20 ng/mL TNFα、20 μmol/mL虫草素、40 μmol/mL虫草素、20 ng/mL TNFα+20 μmol/mL虫草素、20 ng/mL TNFα+40μmol/mL虫草素刺激，对照组为5%FBS DMEM培养液。24 h后用DHanks液冲洗，冰上裂解细胞，收获蛋白。取适量待检测蛋白用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，将已分离的条带电转移到PVDF膜上，4 ℃封闭过夜，加入配置好的一抗(1∶200稀释)、二抗(1∶10 000稀释)孵育，用ECL化学发光试剂盒检测。βactin检测作为内对照。实验胶片用光密度扫描仪扫描，结果用图像软件BIORAD Quantity One分析。

　　1.5 统计学分析

　　各组A值用均数±标准差(±s)表示，用SPSS 16.0软件进行数据录入和统计分析。采用析因方差分析，两样本均数比较采用独立样本t检验;多组均数比较采用单向方差分析;组间多重比较，方差齐性采用LSD检验，方差不齐采用GamesHowell检验，P<0.05为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 虫草素对TNFα诱导的大鼠VSMCs增殖的影响

　　MTS/PMS法测定各组细胞增殖率分别为：对照组0.666±0.098，TNFα 20 ng/mL组1.013±0.150，20 μmol/mL虫草素组0.660±0.097，40 μmol/mL虫草素组0.676±0.085，TNFα 20 ng/mL联用20 μmol/mL虫草素组0.662±0.107，TNFα 20 ng/mL联用40 μmol/mL虫草素组0.627±0.135。统计分析结果表明，与对照组比较，20 ng/mL TNFα组能明显刺激大鼠VSMCs的增殖(P<0.05)，而20 μmol/mL虫草素、40 μmol/mL虫草素组单独应用对大鼠VSMCs的增殖均无明显影响(P>0.05)。20 μmol/mL虫草素联用20 ng/mL TNFα、40 μmol/mL虫草素联用20 ng/mL TNFα组与20 ng/mL TNFα组比较对VSMCs增殖均有明显的抑制作用(P<0.05)，但未存在剂量依赖性(见图1)。

　　以目的蛋白对照组灰度值与内参对照组灰度值的比值为1，其余各组syndecan4蛋白表达量分别为：TNFα 20 ng/mL组1.375±0.017，20 μmol/mL虫草素组1.009±0.120，40 μmol/mL虫草素组1.002±0.050，TNFα 20 ng/mL+20 μmol/mL虫草素组0.962±0.057， TNFα 20 ng/mL+40 μmol/mL虫草素0.914±0.057(如图2) 。与对照组比较，TNFα组能明显刺激VSMCs的syndecan4蛋白表达(P<0.05);而虫草素不同剂量组单独应用对VSMCs的syndecan4蛋白表达均无明显作用(P>0.05)。TNFα联合虫草素共同作用组与TNFα组比较对VSMCs的syndecan4蛋白表达均有显著抑制作用(P<0.05)(见图3)。重复3次得到相同的结果。

　　3 讨 论

　　炎症反应贯穿于脑血管动脉粥样硬化的起始、病变进展及斑块破裂、血栓形成的全过程。TNFα是炎症反应的关键调节因子之一，TNFα主要由巨噬细胞产生， [JP+1〗与正常细胞相比， 在动脉粥样硬化病

　　Figure 3 Effects of cordycepin on syndecan4 protein expression in rat vascular smooth muscle cells induced by TNFα变中其表达上调，在动脉粥样硬化斑块局部的血管平滑肌细胞中发现有TNFα的mRNA表达。血管平滑肌细胞表面具有TNFα受体，是TNFα作用的靶细胞。TNFα与血管平滑肌细胞上的相应受体结合后可以促进细胞的有丝分裂过程。

　　研究表明，syndecan4在炎症及组织创伤愈合中发挥着重要的作用[4]。Syndecan4主要在血管平滑肌细胞上表达，其表达在动脉损伤早期即可增加，随后在7 d内减少到可控制的水平。在内皮组织裸露的动脉，血管中层平滑肌syndecan4的mRNA占整个血管壁的70%～90%。Rauch [5]等研究发现syndecan4是凝血酶诱导人VSMC迁移和增殖反应所必需的成分，凝血酶通过诱导sydnecan4蛋白的表达上调，从而激活p44/42 MAPK。Telci[6]等研究显示，在组织损伤修复中，syndecan4可与纤维结合蛋白转谷氨酰胺酶复合物结合，激活蛋白激酶Cα后，syndecan4聚集并与β1整合素结合，激活细胞存活机制及RGD依赖的细胞黏附，从而导致MAPK途径激活及肌动蛋白应力纤维形成。Houston[7]等报告了氧化型亚油酸能够刺激大鼠和人的VSMC增殖并上调syndecan4的表达。新近的研究提示，syndecan4作为一种重要的跨膜蛋白，是信号从细胞表面传导到细胞内部的重要传递者，也是细胞外信号引起细胞增殖反应的重要递呈者。位于细胞表面的syndecan4主要通过激活蛋白激酶Cα参与细胞的信号传导。在细胞因子等致动脉粥样硬化因素的刺激下，syndecan4通过硫酸乙酰肝素链与胞外的配体相结合，并调节其活性，经保守的跨膜区传导进入胞内，在其胞质尾区发生一系列的去磷酸化作用及寡聚化作用，使syndecan4与PIP2的亲和力增强，从而激活了蛋白激酶Cα，进一步激活了p44/42 MAPK，从而启动了大多数促细胞增殖的共同途径ERK途径。至于TNFα是如何影响syndecan4蛋白的表达，Zhang[8]等的实验证明了主要是通过两种机制来实现:一种是通过NFκВ介导的方式来增加syndecan4的基因表达;另一种是延长syndecan4mRNA的半衰期。

　　冬虫夏草是名贵中药材，具有多种药理作用，《本草从新》中记载：“保肺益肾，止血化痰，止劳嗽。” 冬虫夏草味甘、性平，归肺肾二经。主要功效为补肾阳、益肾精、补肺气、祛痰止咳、平喘。虫草素为冬虫夏草的主要药理活性成分之一，具有免疫调节作用、抗炎作用及抗肿瘤等作用。Zhou[9]等进行的体外实验证实虫草素能通过促进人外周单核细胞白介素10的分泌和白介素10 mRNA的表达来参与抗炎反应。De Jong [10]等发现虫草素能通过诱导调节性T细胞增殖来影响炎症反应。近年来发现，虫草素对转录因子NFκВ的抑制作用是其发挥抗炎作用的重要机制。NFκВ是合成蛋白的重要转录因子。虫草素抑制了NFκВ的从胞浆到核内易位和表达。在Kim [11]等的实验中，为了明确虫草素的抗炎机制，检测了脂多糖激活的RAW264.7巨噬细胞中Akt和MAP激酶的活性，在剂量依赖模式中，虫草素能显著抑制巨噬细胞中Akt和p38MAPK激酶的磷酸化，从而抑制了NFκВ从胞浆到核内的易位;除了通过抑制上述两种激酶而影响NFκВ外，虫草素还可以抑制转录因子抑制剂IκB alpha 的磷酸化，延长其降解时间。虫草素通过抑制NFκВ的作用，导致 iNOS和COX2基因表达下调，使NO产物的生成减少，最终的结果是抑制了炎症反应。YoungRae Lee[12]等人也证明了虫草素可以通过抑制NFκВ而完全限制了受紫外线激发的表皮成纤维细胞中MMP1和MMP3的表达。因此，可以推测虫草素通过影响众多细胞因子的表达而发挥抗炎作用，而它对NFκВ的抑制作用是其中关键的一环。本实验提示一定剂量的虫草素能够显著抑制TNFα诱导的VSMCs增殖和syndecan4蛋白表达。推测可能的机制是TNFα通过与VSMCs表面的相应TNF受体结合，使NFκВ的表达和易位增加，从而在基因水平使syndecan4蛋白的表达增加，随后激活p44/42MAPK信号传导通路，导致血管平滑肌细胞增殖，而虫草素可能通过阻断TNFα介导的NFκВ的易位和表达，从而使TNFα诱导的syndecan4蛋白的表达下降，减少蛋白激酶Cα的激活，从而进一步抑制p44/42MAPK的磷酸化，最终导致大鼠VSMCs增殖的减少。

　　综上所述，本研究表明一定剂量的虫草素能够显著抑制TNFα诱导的大鼠VSMC增殖和syndecan4蛋白表达。因此，有必要进一步研究虫草素抑制syndecan4蛋白表达的相关潜在靶点。

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