HPLC法测定皮肤丸中盐酸小檗碱的含量

　　　　　　 作者：罗亦芬，程艳阳，谢友莲，黄爔乐，陈欣瑜

【摘要】 目的 建立皮肤丸中盐酸小檗碱的含量测定方法。方法 采用HPLC法，色谱柱为Welch Malerials XBC18柱，乙腈0.02 mol·L-1磷酸溶液(体积比25∶75)为流动相，流速为1.0 mL·min-1，检测波长为424 nm，柱温为35 ℃。结果 盐酸小檗碱的质量浓度在3.814～38.14 μg·mL-1范围内与峰面积线性关系良好;平均回收率为99.1%，RSD为0.8%(n=9);最低检测限为0.942 7 ng。结论 本方法操作简便、结果准确，能有效地控制该制剂的质量。

【关键词】 皮肤丸;盐酸小檗碱;高效液相色谱法

　Abstract:Objective To establish an HPLC method for determining the content of berberine hydrochloride in Pifu pills. Methods A Welch Materials XBC18 column was used to analyze the sample by using acetonitrile0.02 mol/L phosphoric acid solution(25∶75)as mobile phase. The flow rate was 1.0 mL/min and detection wavelength was 424 nm. Results The standard curve for berberine hydrochloride was linear in the concentration range of 3.814～38.14 μg/mL. The average recovery was 99.1% with RSD 0.8% (n=9). Conclusion This method was simple，accurate and reliable for the quality control of Pifu pills.

　　Key words:Pifu pills; berberine hydrochloride;HPLC

　　皮肤丸由关黄柏、蛇床子、防风等组成，具有养血祛风、燥湿止痒的功效。为了更好控制该制剂的质量，通过查阅处方中各药材植化分析有关资料，选择对处方中主要药材关黄柏[1]中盐酸小檗碱的含量测定方法进行研究。在参照文献[1，2]的基础上，建立了本品中盐酸小檗碱含量测定方法。该方法操作简便、结果准确，能有效地控制该制剂的质量。

　　1 仪器与试药

　　Agilent 1100型(VWD)高效液相色谱仪(美国);色谱柱为Welch Malerials XBC18;HN1006超声清洗仪(广州市华南超声设备有限公司);盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号110713200609);皮肤丸(自制，批号LB0024、LB0038、MB0016);盐酸、甲醇为分析纯;磷酸、乙腈为色谱纯;水为超纯水。

　　2 方法与结果

　　2.1 对照品溶液的制备

　　取105 ℃干燥5 h的盐酸小檗碱对照品适量，精密称定， 加1% (体积比) 盐酸甲醇溶液制成每

　　1 mL含8 μg的溶液，即得。

　　2.2 供试品溶液的制备

　　取本品粉末(过三号筛) 约1 g， 精密称定， 置50 mL容量瓶中，加1%(体积比)盐酸甲醇溶液约40 mL，超声处理(功率300 W，频率25 kHz)30 min，放冷，加1%(体积比)盐酸甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，静置，取上淸液，用0.45 μm微孔滤膜，滤过，取续滤液，即得。

　　2.3 阴性对照溶液的制备

　　依照处方中的比例，按制法制备缺关黄柏的阴性对照样品，按供试品溶液的制备方法制备，即得。

　　2.4 色谱条件与系统适用性试验

　　以Welch Malerials XBC18为色谱柱;以乙腈0.02 mol/L磷酸溶液(体积比25∶75)为流动相;检测波长为424 nm。分别精密吸取缺关黄柏阴性对照溶液、对照品溶液与供试品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1。结果表明：阴性对照不干扰，理论塔板数按盐酸小檗碱计算为10 412，相邻两峰的分离度为2.26，拖尾因子为0.89。

　　2.5 线性关系考察

　　取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，用1%(体积比)盐酸甲醇溶液制成每1 mL中分别含含3.814、7.628、19.07、30.51、38.14 μg的溶液，分别精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，按“2.4”项下的方法测定，以质量浓度(ρ)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：

　　A=8.73613ρ-0.0511939，r=0.999 9(n=5)

　　结果表明盐酸小檗碱的质量浓度在3.814～38.14 μg·mL-1范围内与峰面积线性关系良好。

　　2.6 精密度试验

　　取同一对照品溶液(38.14 μg·mL-1)，重复进样6次，结果盐酸小檗碱平均峰面积为332.447 75，RSD为0.16%(n=6)。

　　2.7 重复性试验

　　取同一批样品(批号LB0024)6份，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液6份，按“2.4”项下的方法测定，结果盐酸小檗碱的平均含量为0.446 7 mg·g-1，RSD为1.7%(n=6)。

　　2.8 稳定性试验

　　取同一份供试品(批号LB0024)溶液，分别于0、2、4、7、24 h按“2.4”项下方法，测定峰面积，结果其RSD为1.2%(n=5)，表明供试品溶液在24 h内稳定。

　　2.9 加样回收率试验

　　取已知含量的样品(LB0038)粉末1 g，精密称定，共9份，分别置50 mL容量瓶中，分别精密加入盐酸小檗碱对照品溶液适量，按“2.2”项下方法制备，依法测定，结果见表1。表1 盐酸小檗碱加样回收率试验测定结果

　　2.10 样品测定

　　取皮肤丸3批，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进行测定，计算。结果3个批号的样品中盐酸小檗碱含量分别为0.446 7、0.501 7、0.569 9 mg·g-1。

　　3 讨 论

　　3.1 波长选择

　　取对照品溶液(38.14 μg·mL-1)于200～500 nm波长范围内扫描，结果盐酸小檗碱在230、266、347、424 nm处有最大吸收。分别选择266、347、424 nm作为检测波长进行试验，以266、347 nm作为检测波长时灵敏度较高，但空白溶液有干扰;以424 nm作为检测波长时可有效消除干扰，检测灵敏度也达到检测要求，故选择424 nm作为检测波长。

　　3.2 流动相的选择

　　分别对乙腈0.02 mol·L-1磷酸(体积比25∶75)、乙腈0.05 mol·L-1磷酸氢二钾(体积比28∶72)、乙腈0.1%磷酸(体积比50∶50)(每100 mL中加十二烷基磺酸钠0.1 g)3种流动相进行考察，结果以第1种流动相分离效果最佳。

　　3.3 提取溶剂的选择

　　分别对水、10%(体积比)盐酸溶液、0.02 mol·L-1磷酸溶液、1%(体积比)盐酸60%甲醇溶液、1%(体积比)盐酸甲醇溶液作为提取溶剂进行了考察，结果表明1%(体积比)盐酸甲醇溶液提取效果最好。

　　3.4 提取方式的选择

　　用1%(体积比)盐酸甲醇溶液作为提取溶剂，分别对索氏、回流、超声提取方法进行了考察，结果以超声的提取方式效果最佳，提取完全，且操作简便。

　　3.5 提取时间的选择

　　分别对超声15、30、45、60 min的提取效果进行考察，结果以超声30 min效果最佳。

　　3.6 进样量的选择

　　盐酸小檗碱在424 nm的波长处响应较小，试验中尝试增加进样体积以加大盐酸小檗碱的峰面积，但随着进样体积的增加，峰拖尾增大， 在进样量为20 μL时拖尾因子达到2。故综合考虑，确定进样体积为10 μL。

参考文献