肌肽对应激负荷小鼠糖代谢的影响

　　　　 作者：阳冬辉，李怡芳，姚楠，何蓉蓉，栗原博

【摘要】 目的 研究肌肽对应激负荷小鼠糖代谢的影响。方法 将雄性KM小鼠分为正常对照组、应激对照组、150 mg/kg及300 mg/kg肌肽给药组，每天灌胃给药1次，连续给药7 d后拘束负荷应激20 h灌胃葡萄糖2 g/kg，检测血糖清除率、肝糖原合成能力、糖原合成酶基因表达及皮质酮水平。结果 与应激负荷对照组比较，肌肽能提高应激小鼠血糖消除速率，促进糖原合成酶的基因表达，并增强肝糖原合成能力。此外，肌肽还能降低血浆皮质酮的水平。结论 肌肽增强应激负荷小鼠肝糖原合成能力，其作用机制可能与肌肽降低体内糖皮质激素水平、激活糖原合酶有关。

【关键词】 肌肽;拘束应激;肝糖原;糖皮质激素

　　Abstract:Objective To study the effect of carnosine on glycometabolism in restraintstressed mice. Methods Male KM mice were randomized into normal control group，stress control group，150 and 300 mg/kg carnosine groups，which were intragastrically administered once a day consecutively for 7 days，and then intragastrically administered with glucose at 2 g/kg restraint stress for 20 hours; the glucose elimination rate，hepatic glycogen synthesis，gene expression of glycogen synthetase，and corticosterone level were determined.Results Compared with the control group，carnosine accelerated the basic glucose metabolism，upregulated the mRNA expression of glycogen synthase，elevated the liver glycogen synthesis in restraintstressed mice. And it also reduced the plasma corticosterone level.Conclusion Carnosine could improve hepatic glycogen synthesis in restraintstressed mice. The mechanism might be related to the degression of glucocorticoids and the activation of glycogen synthase.

　　Key words:carnosine; restraint stress; liver glycogen; glucocorticoids

　　 近年来随着社会环境及生活方式的改变，生活及工作的压力越来越大，由各种应激源导致的亚健康状态人数也逐年增多。人们长期处于应激负荷状态下容易导致免疫力下降，导致各种疾病的发生。肌肽是一种具备高效生物活性的天然二肽，广泛存在于哺乳动物的肌肉组织和神经组织中[1]。研究结果表明，肌肽具有抗氧化抗衰老功能、神经系统保护作用、抗糖基化作用、对肾中毒及肝损伤有一定的改善作用、可防止动脉硬化等生理活性[2，3]。但尚未见肌肽对应激负荷状态下糖代谢改善作用的报道。本实验通过观察肌肽对拘束负荷小鼠血糖浓度和肝糖原合成的影响，以及小鼠血浆中皮质酮变化，探讨肌肽对应激引起的机体糖代谢紊乱的改善作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂

　　肌肽(carnosine)、皮质酮(corticosterone)标准品及氢化可的松(cortisol)标准品为美国Sigma公司产品;乙腈(色谱纯)为Fisher Scientific公司产品;乙酸乙酯和NaOH为广州化学试剂厂产品;葡萄糖购自天津药业;肝糖原试剂盒购自南京建成科技公司;葡萄糖测定试剂盒购自上海荣盛生物药业公司;Trizol购自广州英韦创津生物科技公司;逆转录系统PCR试剂盒均购自北京天根生化科技公司;PCR引物根据GenBank提供的基因序列使用Primer Design软件进行设计，引物均由英韦创津公司合成，糖原合酶2(Gy2)引物：5′AACGAC AGCCGATGAGT3′(上游)，5′CTGGCACG AGAAAGGAT3′(下游)，其扩增产物长423 bp;以18s为内参：5′GGGAGA GCGGGTAAGAGA3′(上游)，5′ACAGGACTAGGC GGAACA3′(下游)，其扩增产物长241 bp。

　　1.2 实验仪器

　　高效液相色谱系统(日本HITACHI公司);MK3型酶标仪(Labsystem，Finland);318K型台式高速冷冻离心机(德国Sartorius公司);2720型PCR仪(美国Applied Biosystems公司);电泳成像系统(美国BioRad Laboratories公司);Milli Q Plus超级纯水仪(美国Millipore公司);电泳仪及水平电泳槽为日本Mupid公司产品。

　　1.3 实验动物

　　体质量18～22 g，6周龄SPF级雄性昆明种小鼠32只，购自广东省医学实验动物中心，许可证号SCXK(粤)20080002。饲养温度(23±2) ℃，照明时间12 h/d (7∶00～19∶00)，饲养1周后进行实验。

　　1.4 动物分组及给药

　　将小鼠随机分为正常对照组、拘束应激对照组、150 mg/kg及300 mg/kg肌肽给药组，共4组，每组8只。肌肽给药组以0.1 mL/10 g灌胃给药，正常对照组和拘束应激模型组均灌胃等量空白水，每日1次连续给药7 d。除正常对照组外，所有小鼠均在末次灌胃后30 min进行拘束应激实验，小鼠拘束装置参照文献[4]制作，为通风良好的50 mL尖底聚丙烯塑料离心管，给予一次性拘束20 h(12:00～次日8:00)，拘束期间小鼠不能进食饮水。正常对照组小鼠为禁食禁水小鼠。

　　1.5 小鼠糖耐受实验[5]

　　上述各组实验动物在禁食和拘束结束30 min后灌胃葡萄糖2 g/kg，口服葡萄糖后0、20、40、60及80 min尾静脉取血于肝素钠小离心管中，5 000 r/min 5 min离心，取血浆用葡萄糖测定试剂盒测定血糖浓度。

　　1.6 HPLC测定小鼠血浆皮质酮的含量

　　取小鼠全血置于肝素处理过的离心管中，以5 000 r/min 离心5 min分离血浆。取0.5 mL 血浆，并添加入2 mL乙酸乙酯振摇萃取，分离得到上层乙酸乙酯液，下层水液再用乙酸乙酯萃取1遍，合并乙酸乙酯液后用0.1 mL NaOH 洗1次，再用蒸馏水洗2次。乙酸乙酯液置于氮气下挥发吹干后加入100 μL流动相(乙腈∶水=38∶72，体积比)溶解即得皮质酮分析样品溶液。按Woodward等人的方法，采用HPLC内标法(内标物为cortisol)测定血浆中皮质酮含量[6]。检测条件为：紫外检测，检测波长为254 nm;色谱柱：5C18(4.6 mm×150 mm，5 μm);流动相：乙腈水(38%∶72%);流速：1 mL/min。

　　1.7 肝糖原合成测定

　　测定血糖浓度后，小鼠在乙醚麻醉下取出肝脏，按肝糖原试剂盒方法测定肝糖原含量。

　　1.8 半定量RTPCR检测Gy2 mRNA的表达

　　取肝脏组织，用Trizol提取总RNA，逆转录反应以总RNA 3 μg为模板，总反应体系20 μL，42 ℃水浴1 h合成cDNA。PCR反应条件设置：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火 40 s，72 ℃延伸50 s，进行30次循环，最后72 ℃延伸7 min，同法以18s为内参进行PCR扩增。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，Biorad凝胶成像系统记录结果，Quantity One软件进行灰度分析。结果以Gy2与内参照物18s mRNA扩增片段灰度值的比值表示Gy2 mRNA相对水平。

　　1.9 数据统计与分析

　　实验数据以(±s)表示，采用SPSS软件，利用ANOVA检验进行统计学处理，P<0.05为差异有显著性。

　　2 结果

　　2.1 肌肽对拘束负荷小鼠糖耐受的影响

　　结果见表1、图1。口服2 g/kg葡萄糖后与正常对照组相比，拘束应激小鼠的血糖浓度上升明显，在20、40和60 min时具有统计学差异。与应激对照组相比(P<0. 01)，肌肽高低剂量给药组均能使应激小鼠血糖浓度明显降低，提高糖耐受能力，结果表明肌肽能提高应激小鼠血糖消除速率。表1 肌肽对拘束应激小鼠糖耐受的影响与正常对照组比较：*P<0. 05，**P<0. 01;与应激对照组比较：△P<0. 05，△△P<0. 01

　　2.2 肌肽对拘束负荷小鼠血浆皮质酮水平及肝糖原合成的影响

　　结果见表2，与正常对照组相比，拘束应激使小鼠血浆皮质酮水平显著上升(P<0.01)，肝糖原合成能力显著下降(P<0.01)。与应激对照组相比，肌肽高低剂量给药组均能降低拘束应激引起的血浆皮质酮上升(P<0.01)，促进肝糖原的合成(P<0.05)。

　　2.3 肌肽对拘束应激小鼠糖原合成酶表达的影响

　　目的基因Gy2(糖原合成酶)与内参基因18s的RTPCR扩增产物的A目的基因/A内参基因能反映Gy2基因的转录水平，比值越大， Gy2转录水平就越高。如图2和图3所示，与正常对照组相比，拘束应激后Gy2的表达明显降低，与空白对照组比较差异非常显著(P<0.01)。高低肌肽给药组Gy2的表达明显升高，与拘束应激组比较差异显著(P<0.05)。表2 肌肽对拘束应激小鼠血浆皮质酮水平和肝糖原合成的影响

　　3 讨论

　　机体在应激负荷时激活交感神经肾上腺髓质系统，产生大量儿茶酚胺、兴奋性氨基酸，导致下丘脑垂体肾上腺轴(HPA)功能亢进，血液中皮质醇浓度增高[7]。糖皮质激素的释放增加，促进糖原分解和糖异生作用，抵制外周组织对葡萄糖的转运和利用，快速升高血糖[8]。实验结果表明，小鼠拘束应激20 h口服葡萄糖后血糖浓度显著升高，血糖值在20、40、60 min时显著增加。150、300 mg/mL肌肽给药能降低拘束应激小鼠血糖浓度，改善因应激负荷导致的血糖利用率低下。同时150、300 mg/mL肌肽给药能显著降低拘束应激小鼠血浆皮质酮水平，促进肝糖原合成，降低糖皮质激素水平，增强葡萄糖的储备，改善了机体应激后导致的能量供应不足的状况。

　　糖原合酶(glycogen synthase，Gys)是肝和肌肉糖原合成的关键限速酶，其中糖原合酶2(Gy2)主要存在于肝脏中，调节肝糖原的合成。糖皮质激素通过调控cAMP和Ca2+这2个信号分子，激活糖原合成酶激酶使糖原合成酶磷酸化而活性降低[9，10]。本实验结果表明150、300 mg/mL肌肽给药能够促进Gy2 mRNA表达，提高肝糖原合成能力，其机制可能与肌肽能显著改善机体糖皮质激素水平，激活糖原合成酶激酶，继而使糖原合成酶去磷酸化被激活有关。

　　肌肽作为一种新型高效天然抗氧化肽受到了国内外普遍关注，肌肽不仅具有抗氧化，抗糖基化，提高免疫力和缓解老年性疾病等作用，而且近年来肌肽药物已经开发应用于临床。本研究结果显示肌肽能显著提高拘束应激小鼠血糖利用率，降低血浆皮质酮水平，促进肝糖原合成能力及改善机体能量利用不足等作用，为肌肽的应用与开发提供一定的实验依据。

参考文献

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