HPLCDADELSD法同时测定威灵仙药材中齐墩果酸和常春藤皂苷元的含量

【摘要】 目的 建立以蒸发光散射检测器(ELSD)和二极管阵列检测器(DAD)测定威灵仙药材中齐墩果酸和常春藤皂苷元的高效液相色谱分析方法。 方法 色谱柱： Merck Lichrocart C18柱 (4.0 mm×250 mm，5 μm);流动相: 甲醇水冰醋酸三乙胺(体积比87∶13∶0.04∶0.02);流速：1.0 mL·min-1;柱温：30 ℃;DAD检测波长为210 nm;ELSD蒸发管温度为80 ℃，气体压力为172.375 kPa。结果 常春藤皂苷元、齐墩果酸线性范围分别为1.43～14.3 μg和2.1～21.0 μg;常春藤皂苷元和齐墩果酸在以DAD检测时的加样回收率分别为98.02%、98.94%，RSD分别为2.61%、2.34%;在以ELSD检测时的加样回收率分别为98.72%、100.03%，RSD分别为2.51%、2.22%。结论 本方法简便、重现性好、专属性强，为完善威灵仙药材质量控制标准提供了科学依据。

【关键词】 威灵仙;齐墩果酸;常春藤皂苷元;高效液相色谱法;蒸发光散射检测器;二极管阵列检测器

Abstract:Objective To determine the content of oleanolic acid and hederagenin from Radix Rhizoma Clematidis by RPHPLCELSDDAD at the same time. Methods A Merck Lichrocart C18 column(4.0 mm×250 mm，5 μm) was used. The mobile phase was consisted of methanolwateracetic acidtriethyl amine(87∶13∶0.04∶0.02) with a flowrate of 1.0 mL·min-1， and the column temperature was 30℃. The DAD detection wavelength was 210 nm; The ELSD drifttube temperature was 80℃， and gas pressure was 172.375 kPa.Results The linear ranges of hederagenin and oleanolic acid were 1.43-14.3 μg and 2.1-21.0 μg respectively. The average recovery of hederagenin and oleanolic acid were 98.02%(RSD=2.61%)，98.94%(RSD=2.34%) determined by DAD， and 98.72%(RSD=2.51%)， 100.03%(RSD=2.22%)determined by ELSD.Conclusion It’s a reliable and accurate method for the quality control of R. Clematidis.

　　Key words:Rhizoma Clematidis; oleanolic acid; hederagenin; HPLC; ELSD; DAD

　 威灵仙来源于毛茛科植物威灵仙chinensis Osbeck、棉团铁线莲Clematis hexapetala Pall. 或东北铁线莲Clematis manshurica Rupri.的干燥根及根茎，为中国药典2005年版收载品种[1]。具有祛风除湿、通络止痛之功，用于治疗风湿痹痛，肢体麻木，筋脉拘挛，屈伸不利，骨鲠咽喉。中国药典只对本品进行以齐墩果酸为对照品的薄层色谱鉴别，无定量控制项目。文献[2]报道本品主要有效成分为三萜皂苷类，其苷元为齐墩果酸和常春藤皂苷元。目前常采用TLC法[3]、HPLCUV[2，4]法测定齐墩果酸含量，检测波长为220或215 nm;TLC法条件要求较苛刻，重现性差;而HPLCUV法测定时，因齐墩果酸属于五环三萜类成分，在紫外204 nm有末端吸收，故受流动相影响较大，分离不够理想，检测灵敏度较低。常春藤皂苷元亦属五环三萜类成分，目前尚未见采用HPLCUV法或HPLCELSD法测定其含量的报道。本文首次采用HPLCELSDDAD法同时测定了威灵仙药材中齐墩果酸和常春藤皂苷元的含量，通过对2种检测器测定结果的对比研究，为威灵仙药材质量控制方法提供实验依据。

　　1 仪器与试药

　　Waters 2695高效液相色谱仪(2996 DAD及2420 ELSD检测器);Empower化学工作站;Sartorius电子分析天平(德国，d=0.01 mg)。甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯。齐墩果酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号110709-200505)，常春藤皂苷元对照品(中国药品生物制品检定所，111733200502)。威灵仙药材购于武汉市药材公司，经武汉解放军第一六一医院胡华主管药师鉴定为毛茛科植物威灵仙chinensis Osbeck的干燥根及根茎。

　　2 方法与结果

　　广东药学院学报 第26卷 第1期 齐帅，等.HPLCDADELSD法同时测定威灵仙药材中齐墩果酸和常春藤皂苷元的含量2.1 色谱条件和系统适用性试验 色谱柱：Merck Lichrocart C18柱(4.0 mm×250 mm， 5 μm)，加预柱;流动相：甲醇水冰醋酸三乙胺(体积比87∶13∶0.04∶0.02);流速：1.0 mL·min-1;柱温：30 ℃;紫外检测器检测波长为210 nm;蒸发光散射检测器的蒸发管温度为80 ℃，气体压力为172.375 kPa。分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1。

　　A.对照品溶液; B.供试品溶液;1.常春藤皂苷元; 2.齐墩果酸

　　图1 威灵仙的HPLC图

　　Figure 1 HPLC Chromatograms of Rhizoma Clematidis

　　2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取齐墩果酸、常春藤皂苷元对照品适量，分别加甲醇制成齐墩果酸质量浓度为2.100 mg· mL-1、常春藤皂苷元质量浓度为1.430 mg·mL-1的对照品溶液。临用时精密量取等量对照品溶液混匀，即为混合对照品溶液。

　　2.3 供试品溶液的制备 取威灵仙药材粉末(过4号筛)2 g，精密称定，加甲醇50 mL，按照2005年版中国药典“木通[含量测定]”项下[1]供试品溶液制备方法处理，即得。

　　2.4 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液2、5、8、10、15、20 μL，注入液相色谱仪。DAD检测结果以峰面积(Y)对对照品的进样质量(X)进行线性回归，得回归方程分别为：常春藤皂苷元Y = 953094 X -4227.9，r= 0.999 9;齐墩果酸Y =816930 X-326856，r=0.999 9，进样量分别在1.43～14.3 μg及2.1～21.0 μg范围内线性关系良好。ELSD检测结果以峰面积对数(Y)对对照品进样质量的对数(X)进行回归，得回归方程分别为：常春藤皂苷元Y =1.4438 X+5.8851，r=0.999 1;齐墩果酸Y=1.4438 X+6.1566，r=0.999 2;进样量分别在1.43～14.3 μg及2.1～21.0 μg范围内线性关系良好。

　　2.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL，连续进样6次，测定峰面积，结果DAD检测常春藤皂苷元和齐墩果酸峰面积的RSD分别为1.06%、0.32%;ELSD检测常春藤皂苷元和齐墩果酸峰面积的RSD分别为3.49%、4.01%。

　　2.6 重复性试验 精密称取同一批样品6份，同“2.3”项下方法平行制备，测定，结果DAD检测常春藤皂苷元和齐墩果酸含量的RSD分别为0.82%、0.41%;ELSD检测常春藤皂苷元和齐墩果酸含量的RSD分别为2.97%、3.93%。

　　2.7 稳定性试验 取供试品溶液分别于0、1、2、4、8 h进样10 μL，测定峰面积，常春藤皂苷元和齐墩果酸的RSD分别为1.15%、0.47%;ELSD检测常春藤皂苷元和齐墩果酸的RSD分别为3.64%、4.26%。表明在8h内溶液基本稳定。

　　2.8 加样回收试验 取已知含量的威灵仙药材粉末(过4号筛)1 g，共6份，精密称定，分别精密加入常春藤皂苷元对照品溶液1 mL与齐墩果酸对照品溶液3 mL，同“2.3”项下方法处理，测定，计算加样回收率。结果常春藤皂苷元和齐墩果酸在以DAD检测时的加样回收率分别为98.02%、98.94%，RSD分别为2.61%、2.34%(n=6)，在以ELSD检测时的加样回收率分别为98.72%、100.03%，RSD分别为2.51%、2.22%(n=6)。

　　2.9 样品测定 取不同批号样品，制备供试品溶液，精密吸取10 μL，注入高效液相色谱仪，测定。结果常春藤皂苷元在以DAD检测时的平均含量为0.186%，在以ELSD检测时的平均含量为0.143%;齐墩果酸在以DAD检测时的平均含量为0.791%，在以ELSD检测时的平均含量为0.627%(n=3)。

　　3 讨论

　　3.1 波长选择 分析系统适应性试验时DAD检测器收集的信息可知，齐墩果酸和常春藤皂苷元的最大吸收波长为(210±2) nm，故选择210 nm作为UV测定波长。

　　3.2 二极管阵列检测器(DAD)是测定具有紫外吸收的化学成分含量的常用检测器，而蒸发光散射检测器(ELSD)广泛用于医药、化工等多种领域[5，6]。分析威灵仙药材的DAD及ELSD图谱可知，DAD检测因在近紫外区，干扰较大，峰形不好;而ELSD图谱几无干扰，峰形好，故宜使用ELSD对威灵仙中齐墩果酸和常春藤皂苷元进行含量测定。

　　3.3 采用HPLCDADELSD法同时测定威灵仙药材中齐墩果酸及常春藤皂苷元的含量，方法简便、重现性好、专属性强，为完善威灵仙药材质量控制标准提供了科学依据。

参考文献

　[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2005年版一部[M].北京:化学工业出版社，2005:175，43.

　　[2] 杨林，裴瑾，万德光.威灵仙药材中三萜苷元齐墩果酸含量的HPLC测定[J].天然产物研究与开发，2006，18(2):313-315.

　　[3] 熊慧林，郑茂鑫.薄层扫描法测定威灵仙中齐墩果酸的含量[J].中国中药杂志，2007，32(4):357-359.

　　[4] 谢乐，马晓黎，刘丽芳，等.HPLC测定不同产地威灵仙中齐墩果酸的含量[J].中成药，2009，31(1):100-103.

　　[5]LI W K，JOHN F.Determination of 24(R)pseudoginsenoside F11 in North American ginseng using highperformance liquid chromatography with evaporative light scattering detection[J].J Pharm Biomed Anal，2001，25(2):257-265.

　　[6] BONNIE A，KRISHNA K，MITCHELL A.Rapid determination of artemisinin and related analogues using highperformance liquid chromatography and an evaporative light scattering detector[J].J Chromatogr A，1999，730(1):71-80.