作者：黄文秀， 陈江， 杜志斌， 简小冲
【摘要】 目的 观察辛伐他汀对骨质疏松大鼠骨代谢和股骨生物力学的影响。 方法 将SD大鼠随机分成假手术组(SHAM)、卵巢切除组(OVX)、卵巢切除加辛伐他汀组(OVX+SIM)，每组16只。适应性喂养1周后手术，术后8周给药，OVX+SIM组给予辛伐他汀5 mg·kg-1·d-1，其余2组用等量生理盐水灌服。用药后第4、12周分2批各处死半数大鼠，取血观察各组大鼠的骨源性碱性磷酸酶(BALP)、骨钙素(BGP)的代谢情况。分离股骨进行三点弯曲试验，检测股骨最大载荷、弹性载荷、最大桡度、弹性桡度等生物力学性能。 结果 (1)用药4周，BALP水平OVX+SIM组较OVX组升高(P<0.05)，弹性载荷OVX+SIM组较OVX组降低(P<0.05)。(2)用药12周，BALP水平、BGP水平OVX+SIM组较OVX组升高(P<0.01)，最大载荷、弹性载荷OVX+SIM组较OVX组增加(P<0.05，P<0.01)。(3)用药12周与用药4周时比较，OVX+SIM组BALP水平降低(P<0.01)，OVX+SIM组BGP水平升高(P<0.01)，OVX+SIM组最大载荷、弹性载荷均有明显增加(P<0.01)。 结论 辛伐他汀显著影响去势大鼠的骨代谢，促进成骨，改善骨生物力学性能。
【关键词】 辛伐他汀; 股骨; 生物力学; 疾病模型， 动物; 骨质疏松; 骨钙素; 碱性磷酸酶
辛伐他汀对去势大鼠骨代谢和股骨生物力学影响骨质疏松症(osteoporosis， OP)是以低骨量、骨组织微结构退变、骨脆性增加从而导致发生骨折的危险性升高为特征的一种全身性疾病，其主要危害是骨折，骨骼生物力学性能的降低是骨折发生的主要原因之一。近年发现他汀类药物具有促进骨形成和加速骨折愈合的作用[1-2]。去卵巢大鼠可以较好地模拟妇女绝经后骨质疏松状态，笔者以去卵巢大鼠建立绝经后OP模型，给予辛伐他汀(simvastatin，Simv)灌胃，取血观察大鼠骨代谢的变化，取股骨标本进行三点弯曲试验测定骨生物力学指标[3]。以评价Simv对去卵巢大鼠骨代谢及骨生物力学性能的影响，进一步探讨Simv的抗骨质疏松作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物与分组 选用雌性SD大鼠48只，3～4月龄，体质量240~300 g[上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证号：SCXK(沪)2003-0003]，适应性喂养1周后，随机区组设计分为：假手术组(sham-ovariectomized rats， SHAM)，卵巢切除组(ovariectomized rats， OVX)，卵巢切除加Simv组(OVX+SIM)，每组16只。
1.1.2 试剂与仪器 Simv片(杭州默沙东制药有限公司，进口药品注册证号：h30030704，批准文号：国药准字号J20040032);大鼠血清骨源性碱性磷酸酶(BALP)、大鼠血清骨钙素(BGP)，均为美国ADL公司;电子万能生物力学试验机(CSS-44100型，英国INSTRON公司);全自动生化仪(chemix 180，日本Sysmex公司)。
1.2 方法
1.2.1 造模 1%戊巴比妥纳(4 mL/kg)腹腔注射麻醉。取仰卧位，常规消毒后打开腹腔，切除双侧卵巢。SHAM组以同样术式在卵巢附近切取与卵巢大小相近的脂肪组织。动物自由进食饮水，自然光照。
1.2.2 给药方法 卵巢切除8周后，OVX+SIM组以Simv 5 mg·kg -1·d-1灌胃，(Simv用生理盐水配制成1 mg/mL的混悬液，用前摇匀)，连续12周;SHAM组及OVX组予同等体积生理盐水灌胃。用药4周随机处死半数大鼠，12周处死全部大鼠。
1.2.3 血清生化指标测定 各组大鼠处死前摘除眼球取血5 mL，离心分离血清，-80 ℃保存备用。BALP、BGP测定ELISA定量。
1.2.4 三点弯曲实验 将股骨标本自然解冻置于万能电子生物力学试验机上，保持其湿度，测试温度为23 ℃，以股骨中点为加力点，支座跨距23 mm，加载速度1 mm/min，载荷测量精度为0.01 N，挠度测量精度为0.001 mm，匀速加载至标本断裂。加载时注意股骨标本横截面短轴的方向与加载的力的方向一致;支座及加载压头的形状应加工成马鞍形，可控制长骨试件在加载的过程中基本不发生滚动以减少系统误差。计算机描记出载荷-变形(桡度)曲线，分析实验数据并经过换算得出最大载荷、弹性载荷、最大桡度、弹性桡度。
1.3 统计学处理 数据以x±s表示，采用SPSS 12.0 for windows进行检验及分析，多组间比较采用方差分析，P<0.05为差别有统计学意义。
2 结 果
2.1 血清生化指标测定结果 (1)用药4周，12周OVX+SIM组BALP较OVX组均明显增加(P<0.05，P<0.01);SHAM、OVX、OVX+SIM组内比较，用药12周较4周时均明显减少(P<0.05，P<0.01)。(2)用药4周，12周OVX+SIM组BGP较OVX组差别无统计学意义，OVX组内比较，用药12周较4周时明显减少(P<0.05)，OVX+SIM组内比较，用药12周较4周时明显增加(P<0.01，表1)。
2.2 大鼠股骨三点弯曲实验结果 用药4周，最大载荷SHAM组较OVX组明显增加(P<0.05)，用药12周，OVX+SIM组、SHAM组较OVX组明显增加(P<0.05，P<0.01);OVX+SIM组内比较，用药12周较4周时明显增加(P<0.01)。用药4周，OVX+SIM组弹性载荷较OVX组明显降低(P<0.05)，用药12周OVX+SIM组较OVX组明显增加(P<0.05);OVX+SIM组内比较，用药12周较4周时明显增加(P<0.01)。用药4周，SHAM组最大桡度较OVX组明显降低(P<0.05)。各组间弹性桡度均无显著性差异(表2，3)。表1 血清BALP、BGP测量
SHAM：假手术组;OVX：卵巢切除组;OVX+SIM：卵巢切除加辛伐他汀组. BALP：血清骨源性碱性磷酸酶;BGP：大鼠血清骨钙素. 与OVX组同时间点比较，☆：P<0.05;☆☆：P<0.01;组内比较，#：P<0.05;##：P<0.01.表2 大鼠股骨三点弯曲试验最大载荷与弹性载荷结果
SHAM：假手术组;OVX：卵巢切除组;OVX+SIM：卵巢切除加辛伐他汀组. 与OVX组同时间点比较，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01;组内比较，#：P<0.05，##：P<0.01.表3 大鼠股骨三点弯曲试验最大桡度和弹性桡度结果SHAM：假手术组;OVX：卵巢切除组;OVX+SIM：卵巢切除加辛伐他汀组. 与OVX组同时间点比较，☆：P<0.05.
3 讨 论
BGP是成骨细胞分泌的一种肽类物质，可促进骨钙盐沉积，增加骨细胞的矿化速度，其含量变化直接反映成骨细胞的活性，也直接反映骨形成率或骨转换率。BALP是成骨细胞的一种胞外酶，其含量变化能够直接反映成骨细胞活性。
在骨质疏松发生早期，由于体内雌激素水平降低，机体处于一种高骨转换率的状态，此时体内骨形成和骨吸收均会增高，因此OVX组BLAP水平可维持较高水平，故用药4周，OVX组与SHAM组无明显差异;用药12周，OVX组的血清BALP与SHAM组比较明显下降(P<0.01)，并且OVX组的血清BALP、BGP水平与4周比较也呈现出明显的下降趋势(P<0.05，P<0.01)，说明被切除卵巢的大鼠高骨转换水平逐渐下降进入相对平缓时期，具代偿意义的骨形成逐渐降低，骨吸收和骨形成的偶联逐渐失衡，骨吸收逐渐占据优势，从而在血清学检测上出现了BALP、BGP逐渐下降的趋势。这也反映了成骨细胞的疲惫或失代偿。这和临床上绝经晚期OP相对成骨功能不足而使得骨吸收大于骨形成的表现相一致。本研究结果也与文献报道一致[4-5]。SHAM组血清BALP的下降可能与大鼠的自然衰老有关。
用药4周，OVX+SIM组大鼠的血清BALP增高，与OVX及SHAM组比较均有差别(P<0.05);而血清BGP与其他两组比较没有差别。说明早期即能使成骨细胞活性增加，促进成骨。用药12周，OVX+SIM组大鼠的血清BGP与其他两组比较显著增加(P<0.01)，血清BALP也明显高于OVX组(P<0.05)，反映了随着时间延长，Simv的成骨作用逐渐增强。值得注意的是虽然BALP与BGP同为反应骨转换的指标，但二者在随时间变化上并没有表现出任何相关性。OVX+SIM组的血清BGP随着时间的延长逐渐增高，用药12周与4周比较有显著差别(P<0.01);而血清BALP的水平则明显降低(P<0.01)。这可能是由于BALP和BGP分别代表了不同时期成骨细胞的增殖和分化[6]。这种变化规律和Stein、Michael等的研究报告一致[7-8]。由此笔者推测Simv在早期可能主要是通过增加血清BALP水平促进成骨，随着时间延长则主要通过增加血清BGP水平促进成骨细胞产生骨基质，增强骨基质矿化，从而促进骨形成。
生物力学特性是反映骨的生长代谢情况的一个重要指标，它是骨量、骨结构连续性、骨皮质厚度及骨的材料特性的综合反映[9]。用药4周，OVX组股骨最大载荷和最大桡度均小于SHAM组，差异均有显著性。最大荷载直接反映松质骨骨小梁的骨质、结构的连续性，皮质骨的强度，最大桡度反映骨组织的变形能力。本实验结果说明OVX组大鼠股骨断裂前所能承受的最大载荷以及股骨发生断裂时，股骨中性线偏离原始位置的最大位移均小于SHAM组，表明去卵巢造成股骨强度和整体抗骨折能力下降，符合骨质疏松后骨生物力学性能的本质特征。分析原因可能为去卵巢后，由于体内雌激素分泌减少，机体处于一种高骨转换率的状态，此时体内的骨吸收和骨形成均会增高，两者的净效应表现为骨丢失。而骨质疏松早期主要是松质骨受累，骨小梁变细、断裂，骨小梁减少，骨髓腔变大，导致骨最大载荷和最大桡度下降。
用药4周，OVX+SIM组股骨最大载荷和最大桡度与OVX组差别无统计学意义。说明4周时虽然Simv能使成骨细胞活性增加，促进成骨，但不能防止去势大鼠的骨丢失，可能其成骨作用微弱，也可能其既促进骨形成同时也促进骨吸收。Sirola等的临床研究表明早期Simv并不能防止骨丢失[10]，Frans等报道小剂量的Simv早期促进骨形成也促进骨吸收，使骨量减少[11]。用药12周，OVX+SIM组股骨最大载荷和弹性载荷较4周时明显增加，且为组间最大，差异具有显著性。表明随着时间的延长，Simv的促进成骨作用明显增加，提高了断裂前能承受的最大载荷以及股骨不发生永久形变所能承受的最大载荷，明显改善了股骨的强度。
笔者认为，Simv具有促进骨形成的作用，随时间延长成骨作用加强，能提高股骨的强度，降低骨折发生，为临床骨质疏松的防治增添了实验依据。其促进成骨的作用可能与BLAP和BGP水平密切相关。至于该药物对骨质疏松大鼠股骨力学性能影响的详细机制及药物浓度、作用时间对力学性能的影响，还有待进一步研究。
参考文献
[1] Kiliccoglu S S，Erdemli E. New addition to the statin's effect[J]. J Trauma， 2007，63(1):187-191.
[2] Faber D. Cholesterol drugs show promise as bone builders[J]. Science， 2000，288:2297-2298.
[3] 崔 伟，刘成林. 基础骨生物力学(一)[J]. 中国骨质疏松杂志， 1997，3(4)：82-85.
[4] 章明放，黄凤歧，谭郁彬，等. 去势大鼠血清骨钙素水平及意义[J]. 中国骨质疏松杂志， 1999，5(3):22-24.
[5] 王烨明，曾炳芳. 去势后雌性大鼠体内成骨细胞活性变化的实验研究[J]. 中华创伤骨科杂志， 2006，8(1):59-61.
[6] Stein G S，Lian J B. Molecular mechanism mediating proliferation/differentiation interrelationships during progressive development of the osteoblast phenotype[J]. Endocr Rev， 1993，14:424-444.
[7] Stein E A，Farnier M，Waldstreicher J，et al. Effects of statins on biomarkers of bone metabolism: a randomized trial [J]. Nutr Metab Carpasc Dis， 2001，11(2):84-87.
[8] Chan M H，Mak T W，Chiu R W，et al. Simvastatin increases serum osteocalcin concentration in patients treated for hypercholesterolaemia[J]. J Clin Endocrinol Metab， 2001，86:4556-4559.
[9] 姚新苗，杨 林，王 靖，等. 益骨汤对去势大鼠血清激素水平、骨密度和骨生物力学影响的实验研究[J]. 中医正骨， 2006，18(1):3-4.
[10] Sirola J，Honkanen R，Kroger H，et al. Relation of statin use and bone loss:a prospective population-based cohort study in early postmenopausal women[J]. Osteoporos Int， 2002，13:537-541.
[11] Frans J，Maritz M，Philippa A，et al. Effect of Statins on Bone Mineral Density and Bone Histomorphometry in Rodents [J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2001，21:1636-1641.