作者：黄芳， 吴小南， 陈洁， 汪家梨
【摘要】 目的 研究白藜芦醇(Res)逆转人乳腺癌MCF-7/阿霉素(ADM)细胞多药耐药(MDR)的作用及初步机制。 方法 采用MTT法测定不同浓度Res对MCF-7/ADM细胞的抑制作用、应用金氏公式判断Res和ADM联合效应;同时采用荧光分光光度法对不同浓度Res作用下MCF-7/ADM细胞内的ADM积量进行测定。 结果 Res能提高MCF-7/ADM细胞对ADM的敏感性，ADM联合4 μmol/L Res时逆转倍数为1.950，8 μmol/L为2.178，12 μmol/L为2.355;Res可提高ADM在MCF-7/ADM细胞内的蓄积，耐药细胞MCF-7/ADM内ADM的浓度明显升高(与对照组比较，P<0.05)，且细胞内ADM浓度均随细胞外ADM浓度升高而升高。 结论 Res对ADM抗人乳腺癌MCF-7/ADM细胞具有增敏作用;Res能够部分逆转MDR，其逆转机制与增加ADM药物浓度有关。
【关键词】 藜芦生物碱类;表柔比星;乳腺肿瘤;肿瘤细胞，培养的;抗药性，肿瘤;抗药性，多药
笔者先前的研究表明，白藜芦醇(Resveratrol，Res)联合阿霉素(ADM)对人乳腺癌耐阿霉素细胞(MCF-7/ADM)具有较强的抑制作用，且Res单用或联合ADM对正常肝细胞基本无毒害作用[1]。笔者继续研究Res单用或联合ADM对MCF-7/ADM细胞的增殖抑制效应，以探讨Res对耐药性是否具有逆转作用。
1 材料与方法
1.1 材料 Res(纯度>99%)、二甲基亚砜(DMSO)、甲基偶氮唑蓝(MTT)均购自美国Sigma公司，RPMI-1640培养液(美国Gibco公司);盐酸阿霉素(浙江海正药业股份有限公司，批号H33021980)。人乳腺癌敏感株细胞(MCF-7/S)和MCF-7/ADM细胞购自南京凯基生物发展有限公司。MCF-7/ADM另加1.0 μg/mL ADM以维持其耐药性。
1.2 方法
1.2.1 MTT法测MCF-7/ADM细胞的耐药性 将对数生长期的MCF-7/S和MCF-7/ADM细胞消化后配成2×104 mL-1细胞悬液，接种于96孔板，培养24 h后，加入ADM使其终浓度分别为0.01，0.1，1.0，10和100 μmol/L，并设置调零孔(无细胞孔)、溶剂组(0.1%DMSO)、空白对照组。培养48 h后，加含0.5 mg/mL MTT 200 μL，培养4 h后在酶标仪上测定波长570 nm的OD值。根据公式求出相应的细胞生长抑制率：
细胞生长抑制率=[1-(实验孔OD值/空白对照组OD值)]×100%
再根据ADM抑制MCF-7/S，MCF-7/ADM细胞IC50值求耐药倍数：
耐药倍数=IC50(MCF-7/ADM)/IC50(MCF-7/S)
1.2.2 Res对MCF-7/S和MCF-7/ADM 细胞的抑制作用 将Res加入MCF-7/S、MCF-7/ADM单细胞悬液中，使Res的终浓度分别为4，8，12和16 μmol/L，并设置调零孔、空白对照组、溶剂组(0.1%DMSO)。48 h后行MTT实验。计算细胞生长抑制率。
1.2.3 Res联合ADM对MCF-7/ADM细胞的抑瘤增效和逆转作用 MCF-7/S、MCF-7/ADM细胞分别加入不同浓度的ADM和Res，使ADM的终浓度分别为2，4，6，8和10 μmol/L，Res的终浓度分别为4，8和12 μmol/L，并设置调零孔和空白对照组，培养48 h后行MTT实验。参照文献[2-3]利用金氏公式求Q值，并进行合用效果的判断：
Q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)
Q值在0.85～1.15表示(+)，Q值>1.15～2.0表示(++)，Q值≤0.85～0.55表示(-)，Q值<0.55表示(--)。
同时计算逆转倍数：
逆转倍数=IC50 (化疗药物作用组)/IC50 (化疗药物与多酚类化合物共同作用组)
1.2.4 荧光分光光度法检测 参照文献[4-5]检测MCF-7/ADM细胞内阿霉素浓度的变化。
1.2.4.1 药物浓度——荧光强度标准曲线的绘制 测定0，0.01，0.04，0.16，0.64，2.56和10.24 μmol/L系列的阿霉素溶液的吸光度(激发波长为470 nm，发射波长为585 nm，狭缝宽5 nm)，获得细胞内阿霉素标准曲线方程。
1.2.4.2 细胞内药物浓度的测定 在不同细胞的培养液中加4，8，12和16 μmol/L的Res与4，16和64 μmol/L的ADM，培养3 h后离心，置酸乙醇中于-20 ℃过夜。离心取上清液测定其荧光强度。从标准曲线上查出该上清液中ADM的浓度。
1.3 统计学处理 数据以x±s表示，采用SPSS 13.0软件进行方差分析和回归分析。
2 结 果
2.1 MCF-7/ADM细胞耐药性的确定 ADM对MCF-7/ADM细胞IC50值为21.38 μmol/L;MCF-7/ADM细胞的耐药倍数为54.82倍(表1)。表1 ADM对MCF-7/S细胞和MCF-7/ADM细胞的影响
]2.2 不同浓度Res对MCF-7/S细胞和MCF-7/ADM 细胞的抑制 Res 对 MCF-7/ADM 细胞IC10 值为11.39 μmol/L，Res在两种细胞之间无耐药性(1.35倍，表2)。
2.3 Res联合ADM对MCF-7/ADM细胞的抑瘤增效和逆转作用 对照组的OD值为(1.122±0.011)。经比较，Res与ADM在体外均有相加或增强作用，绝大多数联合用药组的Q> 1.15，表明二者的作用主要表现为协同作用;其逆转倍数随着白藜芦醇浓度的增高而增加(ADM联合4 μmol/L Res时逆转倍数为1.950，8 μmol/L为2.178，12 μmol/L为2.355，表3)。
2.4 荧光分光光度法检测 ADM的标准曲线方程为:
Y=119.316+276.394X，R2=0.957 表2 Res对MCF-7/S细胞和MCF-7/ADM细胞的影响 n=4. Res:白藜芦醇;MCF-7/S：人乳腺癌敏感细胞;MCF-7/ADM：人乳腺癌耐阿霉细胞.表3 Res联合ADM对MCF-7/ADM细胞的抗肿瘤作用
ADM 在上述浓度范围内线性关系良好。在MCF-7/S细胞和MCF-7/ADM细胞中，细胞内ADM 浓度均随细胞外ADM浓度的增加而升高，且耐药细胞MCF-7/ADM内ADM的浓度明显低于敏感细胞MCF-7/S 内ADM 的浓度(P<0.01);当加入Res后，耐药细胞MCF-7/ADM内ADM的浓度明显升高(P<0.05)，且细胞内ADM浓度均随细胞外ADM浓度升高而升高(表4)。表4 Res对ADM在MCF-7/S和MCF-7/ADM细胞的蓄积影响
3 讨 论
ADM是第一个在临床上使用的蒽环类抗癌药，其抗瘤谱广，是治疗乳腺癌最有效的药物之一，但MCF-7/ADM细胞对阿霉素具有耐药性。常用的多药耐药逆转剂如维拉帕米、环孢菌素A等虽具有体外逆转MDR的作用，往往由于严重的毒副作用，难以用于临床。
近年来研究表明，Res能通过多种途径对多种肿瘤细胞有显著抑制作用[6-7]。在逆转肿瘤细胞的耐药性研究中，认为Res能诱导耐药细胞的凋亡，其作用机制可能与逆转mdr-1 mRNA基因表达有关[8-9]。本部分实验提示，4～12 μmol/L Res与2～10 μmol/L ADM在体外联合应用时具有相加或增强作用，绝大多数联合用药组的Q>1.15，表明二者的作用主要表现为协同作用。关于Res抑制肿瘤细胞的有效浓度研究中，Res 浓度在12.5 μmol/L，作用一定时间(48 h) 后就能对Hela 细胞有着明显的抑制增殖作用[10]，本研究结果与其基本一致。Res能明显增强化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)的抑癌效果，65 μmol/L的Res与13 μmol/L的5-FU表现出明显的协同效应，两药联合应用后凋亡细胞比例明显比单用任一种时升高[11]。本研究结果与该结论相似，但本研究的浓度范围不完全相符。这种不同剂量Res发挥相似生物学效应的原因可能是由于不同的研究方法以及选用不同的细胞系导致结果的偏差有关。
探讨两药协同作用的机理时发现，当加入非细胞毒性剂量或低毒剂量的Res后，与对照组比较，耐药细胞MCF-7/ADM内ADM的浓度明显升高，且细胞内ADM 浓度均随细胞外ADM浓度升高而升高。因此，Res能够逆转多药耐药，其逆转机制可能与增加ADM药物浓度有关。笔者认为，应进一步探讨Res增加ADM在耐药细胞内蓄积性的分子机制。
参考文献
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