钙黏素家族相关基因与涎腺腺样囊性癌转移的关系

　　　　　　 作者：佘林， 丁林灿， 王锦锋， 卢友光

【摘要】 　　目的 筛选与涎腺腺样囊性癌转移相关的钙黏素(CDH)家族基因。 方法 对涎腺腺样囊性癌转移能力不同的两个细胞株的基因表达谱进行生物信息学分析，筛选出可能与转移相关的CDH家族基因，通过荧光实时定量PCR技术对相关基因的表达差异进行验证，并用免疫组织化学技术研究有差异的CDH基因在临床样本中的表达及其与转移的关系。 结果 生物信息学分析发现，表达谱中有14个CDH家族基因在两个细胞株中的表达有差异，实时定量PCR验证发现CDH4、CDH5、CDH12在两细胞株之间的表达差别有统计学意义(P<0.05)，免疫组织化学发现CDH12在有转移的临床标本中的表达高于没有转移的标本((P<0.05)。 结论 CDH12可能与涎腺腺样囊性癌的高转移能力有关。

【关键词】 癌， 腺样囊性；涎腺肿瘤； 钙黏着糖蛋白类；聚合酶链反应；免疫组织化学
　　
　　ABSTRACT: Objective To explore the relationship of the expression of cadherin family genes and the metastasis of adenoid cystic carcinoma. Methods The genes of adenoid cystic carcinoma were screened through bioinformatics analysis from ACC2 and ACCM gene expression spectra. The correlative genes involving CDH family were determined. Real timePCR was used to examine the mRNA level of these genes in the ACC2 and ACCM. Then immunohistochemical methods were used to investigate the expression of the genes which were found out above in 80 cases of adenoid cystic carcinoma. Results Forteen kinds of genes were detected from gene expression profile. Real timePCR demonstrated that the expression of CDH4 and CDH12 in ACCM were significantly higher as compared with ACC2 (P<0.05). The expression of CDH5 in ACCM were significantly lower as compared with ACC2 (P<0.05). The expression of CDH12 was significantly higher in the tissues with metastasis and recurrence than without (P<0.05). Conclusion CDH12 may play an important role in the metastasis of adenoid cystic carcinoma.
　　
　　KEY WORDS: carcinoma， adenoid cystic； salivary gland neoplasms； cadherins； polymerase chain reaction； immunohistochemistry

　　涎腺腺样囊性癌是头颈部的常见恶性肿瘤，容易通过血行转移至肺，治疗及预防肺部转移是该病治疗的难点，也是其愈后不良的主要原因[12]。该肿瘤的侵袭和转移也是患者死亡的主要原因。
　　
　　钙黏素(cadherin，CDH)是一类重要的细胞黏附分子，主要介导同型上皮细胞间的粘附并参与细胞分化、形态发生等过程。近年来CDH家族成员在肿瘤中的作用逐渐成为研究热点[34]。但对于其在肿瘤中的作用和机制仍知之甚少。
　　
　　本实验前期构建了涎腺腺样囊性癌转移能力不同的两个细胞株的基因表达谱[5]，在此基础上筛选出可能与转移相关的CDH家族基因，采用实时定量PCR技术和免疫组织化学方法对CDH家族成员与涎腺腺样囊性癌转移的关系进行探讨。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 标本

　　人涎腺腺样囊性癌高转移细胞株ACCM和低转移细胞株ACC2由上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颌面外科肿瘤实验室惠赠。其中ACCM为ACC2经过裸鼠体内连续传代培养分离出的高转移细胞株。免疫组织化学标本为1998-2008年福建医科大学附属第一医院和福建医科大学附属协和医院手术切除并经病理确诊为涎腺腺样囊性癌的肿瘤石蜡组织标本，其中发生转移的23例，未转移57例。

　　1.1.2 主要试剂

　　Trizol试剂（美国Invitrogen公司）、Prime Script RT reagent Kit（日本TaKaRa公司）、SYBR Premix Ex Taq (日本TaKaRa公司)、CDH12抗体 (美国R&D公司)、UltraSensitive SP超敏试剂盒、磷酸盐缓冲液PBS、柠檬酸盐抗原修复液、加强型DAB显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）。

　　1.1.3 主要仪器

　　梯度PCR仪(Mastercycler Gradient 5331，德国Eppendorf公司)、荧光定量PCR仪(TP800，日本TaKaRa公司)、GeneSnap凝胶成像系统(InGenius LHR，英国SynGene公司)、石蜡自动包埋脱水机（HWYQ037，德国Leica公司）、连续切片机（RM2245，德国Leica公司）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 筛选CDH家族基因

　　根据卢友光等构建的涎腺腺样囊性癌基因表达谱，进行生物信息学分析，使用图像分析软件测量出所有片段在凝胶上的迁移距离[5]。SAS统计软件进行曲线拟合，找出最佳拟合曲线，计算各片段bp值。根据拟合结果，以片断大小和所在“表达窗”作参数，按2％容许误差从数据库(Qbiogene Inc．＆ MPBiomedicals Inc公司提供)确定其所对应的基因，每个片段数据均与NCBI GeneBank直接链接，从而对涎腺腺样囊性癌的基因表达谱进行分析初步得出与CDH家族相关基因14种。通过NCBI Genebank 和UCSC查询14种基因的序列，使用Primer3(v.0.4.0)在线设计引物（表1），引物委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。表1 14种基因以及内参照引物（略），Tab 1 14 kinds of genes and internal reference primer（略）。

　　1.2.2 实时定量荧光PCR

　　通过Trizol法抽提RNA，用紫外分光光度仪检测RNA纯度和浓度。纯度和浓度达到实验要求后，将各个样品总RNA稀释至相同浓度，使用Prime Script RT reagent Kit逆转录试剂盒逆转录为cDNA。荧光实时定量PCR反应体系包括：cDNA 2.0 μL；上游引物0.5 μL；下游引物0.5 μL；SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL；去离子水加至总体积25 μL。反应条件：94 ℃加热30 s→94 ℃ 10 s→60 ℃ 30 s，进行40个循环后测定的融解曲线。以前12个循环的荧光值作为荧光本底信号，第4～12个循环的荧光信号的标准差的10倍设定为阈值，以βActin(ACTB)为管家基因，校正每个样品Ct值，数据分析按照Livak KJ等的方法进行[6]。

　　1.2.3 免疫组织化学

　　标本取下后以10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，3 μm连续切片。免疫组织化学验证采用SP三步法。染色后两位病理科医师盲法阅片，显微镜400×高倍镜下随机观察10个视野。评判标准：标本无阳性反应细胞或阳性反应细胞率<10%为阴性（－）；标本阳性反应细胞率介于10%～50%为阳性（+）；>50%为强阳性（++）。

　　1.3 统计学处理

　　数据采用使用SPSS 14.0软件包，所有半定量PCR结果采用两样本t检验，免疫组织化学结果采用秩和检验，以ɑ=0.05作为统计学检验标准。

　　2 结果

　　2.1 从表达谱中获得的CDH家族基因

　　通过对表达谱的分析得出了14个CDH家族相关基因（表1）。

　　2.2 荧光实时定量PCR结果分析

　　对上述14种基因进行荧光实时定量PCR分析，将对照组（ACC2）各个基因的相对表达量定义为1，ACCM细胞中这些基因的相对表达量如图1所示。与ACC2相比较，在这14个基因中，CDH5在ACCM中的表达比其在ACC2中的表达明显降低(P<0.05， n=3)，CDH4、12在ACCM中的表达比ACC2中的表达升高(P<0.05， n=3)，其他的基因在两细胞株之间的表达差别无统计学意义(P>0.05)。

　　2.3 免疫组织化学结果分析

　　CDH12蛋白在转移及非转移涎腺腺样囊性癌组织中表达于细胞质，呈棕黄色或棕褐色颗粒，在涎腺腺样囊性癌的肿瘤细胞中散在表达。在腺样管状型，阳性细胞主要位于腺管样结构(图2B)，而在实性型中则散在分布在癌细胞团中(图2C)。CDH12在转移复发病例中的表达强于非转移病例(P<0.05)。在23例转移复发病例中，强阳性表达15例（65.2%），阳性表达6例（26.09%），阴性2例（8.70%）。而在57例无转移病例中，强阳性表达19例（33.3%），阳性表达33例（57.89%），阴性5例（8.77%），差别有统计学意义。

　　3 讨论
　　
　　涎腺腺样囊性癌是常见的口腔上皮恶性肿瘤之一，目前对于该肿瘤的发生以及高转移的发生机制尚无认识，肿瘤细胞的转移是癌症发展最致命的阶段，90%的患者最后死于肿瘤转移。因此筛选出与涎腺腺样囊性癌转移相关的基因，对于了解该肿瘤的转移机制，预测该肿瘤的预后以及指导临床治疗方案均有重大意义。
　　
　　CDH属亲同性黏附分子，其作用依赖于Ca2+。至今为止，已鉴定出30种以上CDH，它们之间都具有较高的同源性，在介导细胞连接，参与细胞分化，肿瘤的侵袭转移发面均发挥了重要作用。目前对于该家族中研究最多的是ECDH。Henrik认为ECDH表达下调使得肿瘤组织中细胞连接松解，肿瘤细胞不断增生，并使得肿瘤细胞获得较强的侵袭力[7]。ECDH的结构功能异常，也可以使细胞分化降低，从而使得肿瘤细胞侵袭性生长，因此容易出现远处转移[8]。ECDH的阳性表达和卵巢癌的恶性程度有关，阳性表达率越低，肿瘤恶性度就越高[9]。宋娟等认为上调ECDH的表达可以实现对人舌鳞癌的肿瘤生长起到抑制作用[10]。由此可见，CDH家族在不同的肿瘤发生过程中可以起到完全不同的作用。
　　
　　本研究通过对已经构建的涎腺腺样囊性癌基因表达谱的分析得出了CDH家族的14种基因，说明CDH家族和涎腺腺样囊性癌存在相关性。这14种基因可能与涎腺腺样囊性癌的发生发展有关。赖非云等认为E钙粘素在涎腺腺样囊性癌中表达阴性的生存率比表达阳性的生存率低，检测其表达可以评估该肿瘤的预后[11]。目前对于该家族其他基因与涎腺腺样囊性癌发生发展和转移的关系尚不清楚，因此笔者首先在细胞水平对这14种基因进行荧光实时定量PCR分析。结果表明，CDH4，12在ACCM中的表达比其在ACC2中的表达上调。CDH5在ACCM中的表达比其在ACC2中的表达下调。其余基因在两细胞株之间的表达差别无统计学意义。故推测改变这3种基因的表达水平，有可能对涎腺腺样囊性癌的转移能力产生影响。此外，抑制CDH4，12的表达可能起到抑制肿瘤转移的作用；抑制CDH5的表达可能起到促进肿瘤转移的作用。
　　
　　CDH4可看做早期胃肠道肿瘤的一种诊断标志物，对人消化道肿瘤起到抑制作用[12]。CDH5和神经母细胞瘤的预后有关[13]。Umesako认为降低CDH5的表达使得P53的表达下调，CDH5通过影响P53从而在乳腺癌中也发挥作用[14]。CDH12和非小细胞肺癌具有相关性[15]。
　　
　　Zhang等认为E钙粘素在涎腺腺样囊性癌病例中的表达下调，提出其表达水平和涎腺腺样囊性癌的分化有关[16]。本研究运用免疫组织化学技术进一步验证了这三种基因在80例涎腺腺样囊性癌病例中的表达情况。结果发现，CDH12在转移复发病例中的表达明显高于未发生转移的病例(P<0.05)，提示CDH12和涎腺腺样囊性癌的转移有密切联系。笔者认为CDH12的过度表达与涎腺腺样囊性癌的转移相关，故检测CDH12将有助于预测该肿瘤患者的预后，该基因的高表达可能预示着不良的预后。关于其影响肿瘤转移的机制还需要进一步研究。

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