MyD88在OK432诱导树突状细胞成熟中的作用

　　　　 作者：倪秀雄 刘丽燕 刘永建 曾真 袁明洲 陈玄

【摘要】 目的 探讨小鼠骨髓树突状细胞(DCs)髓性分化蛋白88(MyD88)在OK432诱导DCs 成熟中的作用机制。 方法 分离小鼠骨髓单核细胞(BMMCs)，在含10%胎牛血清、重组小鼠粒巨噬细胞集落刺激因子(rmGMCSF)、重组小鼠白细胞介素4(rmIL4)的培养体系中诱导培养，所得的细胞即为DCs。于培养的第5天，将细胞分为3组：对照组不加OK432和MyD88 siRNA;OK432组加入终浓度为5 μg/mL的OK432;RNA干扰组加入MyD88 siRNA 12 h后，再加入5 μg/mL OK432刺激。半定量RTPCR法检测DCs中MyD88的表达;ELISA法检测各组DCs分泌肿瘤坏死因子α(TNFα)和IL12的能力;MTT法检测DCs体外刺激同种混合淋巴细胞增殖的免疫活性。 结果 OK432组DCs的MyD88高表达、TNFα和IL12释放明显增加并能诱导较强混合淋巴细胞反应，而用MyD88 siRNA干扰后以上效应均降低(P<0.05)。 结论 靶向MyD88 siRNA可明显抑制小鼠DCs中MyD88的表达和OK432诱导的DCs成熟，表明MyD88介导OK432诱导的DCs成熟。

【关键词】 树突状细胞; RNA，小分子干扰; 毕西巴尼; 免疫耐受

　　 树突状细胞(dendritic cells，DCs)是目前所知的体内功能最强的抗原提呈细胞(antigenpresenting cell，APC)，能够显著刺激初始T细胞进行增殖，并具有激活免疫应答和诱导免疫耐受双重功能。OK432作为GMP级免疫调节剂可安全、有效地提高恶性肿瘤患者的生存率。Kanzaki等研究发现，OK432与常用的DCs成熟诱导剂脂多糖(LPS)、肿瘤坏死因子α(TNFα)相比，刺激健康人外周血单个核细胞来源的未成熟的DCs成熟的能力更强[14]。Toll样受体(Tolllike receptors，TLRs)及其信号转导途径在调控DCs的成熟过程中起重要作用[5]，而髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)是TLRs信号转导途径中关键的衔接分子。在前期实验中，笔者采用OK432联合肿瘤细胞冻融抗原已成功的诱导了小鼠骨髓源性DCs的成熟[6]，但其信号途径尚不清楚。本实验采用RNA干扰技术抑制小鼠骨髓DCs中MyD88的表达，进一步证实MyD88在OK432诱导DCs成熟中的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 雄性SPF级615小鼠，6～8周龄[大连医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(辽)20040017];RPMI1640干粉培养基(美国GIBICO公司);胎牛血清(FCS，杭州四季青生物工程材料有限公司);重组小鼠白细胞介素4(rmIL4，美国R&D公司);重组小鼠粒巨噬细胞集落刺激因子(rmGMCSF，美国R&D公司);OK432(20081001，山东鲁抗制药公司);红细胞裂解液(139.6 mmol/L NH4Cl、16.96 mmol/L Tris用1 mol/L HCl调pH至7.2);MyD88 siRNA、RNAimate(上海吉玛制药技术有限公司);Trizol(美国Invitrogen公司);逆转录试剂盒(#K1621， MBI Ferments公司);PCR MasterMix(北京天跟生化科技有限公司);MyD88引物(上海生物工程公司);ELISA试剂盒(美国R&D公司);MTT粉(美国Sigma公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 获取骨髓前体细胞 小鼠颈椎脱臼处死，无菌取双侧股骨和胫骨。去除附着的肌肉和结缔组织，剪掉骨两端，用PBS液冲洗骨髓腔，制成骨髓细胞悬液，200目尼龙网过滤，离心弃上清，1∶10的体积比加入37 ℃预温的红细胞裂解液，反复吹打混匀，室温5 min，PBS离心洗涤2次，用含10%FCS的RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为2×106 mL-1，接种于6孔板，培养孵育2 h，吸去悬浮细胞，获得的半贴壁细胞即骨髓单核细胞(bone marrow mononuclear cells， BMMCs)[6]。

　　1.2.2 体外DCs的诱导培养和分组 将贴壁的BMMCs置于含10% FCS、GMCSF(1 000 IU/mL)、IL4(500 IU/mL)的RPMI 1640完全培养液中，37 ℃、体积分数为0.05的CO2条件下继续培养所得细胞即为DCs，分别于第3，5天各全量换液1次并补加细胞因子。于第5天时将细胞分3组：(1)对照组：培养过程中不加OK432和MyD88 siRNA;(2)OK432组：加入终浓度为5 μg/mL的OK432;(3)RNAi组：加入12 h后给予OK432 5 μg/mL刺激。3组细胞继续培养48 h。

　　1.2.3 MyD88 siRNA转染 MyD88 siRNA序列为：

　　5’GAC UGA UUC CUA UUA AAU Att3’

　　5’UAU UUA AUA GGA AUC AGU Ctt3’

　　于500 μL的无血清培养基中稀释5 μg siRNA，加入15 μg RNAimate试剂，37 ℃温育30 min使复合物形成;将复合物加入含DCs的6孔板中，终体积为2 mL[7];继续培养48 h，收集各组DCs及上清。

　　1.2.4 半定量RTPCR分析MyD88的表达 用Trizol分别提取3组细胞总RNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，紫外分光光度计定量及纯度检测。总RNA经逆转录试剂盒合成cDNA，PCR扩增MyD88基因。引物合成如下：

　　MyD88(185 bp)：

　　正义链: 5'CACTCGCAGTTTGTTGGATG3'

　　反义链: 5'CCACCTGTAAAGGCTTCTCG3'

　　内参照GAPDH(496 bp)：

　　正义链: 5'CAAGGTCATCCATGACAACTTTG3’

　　反义链: 5'GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG3’

　　MyD88，GAPDH的PCR反应条件如下：94 ℃ 5 min→94 ℃ 30 s→52 ℃ 30 s→72 ℃ 1 min，32个循环;最终延伸72 ℃ 5 min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统摄像分析，根据目的基因PCR产物与GAPDH基因PCR产物灰度比来判断靶基因的mRNA被siRNA沉寂的程度。

　　1.2.5 ELISA法检测DCs产生的细胞因子 收集第7天的各组DCs上清，严格按ELISA试剂盒说明操作，每组设3个复孔，结果取3孔均值。

　　1.2.6 混合淋巴细胞反应(alloMLR) 取小鼠的脾脏，制备脾细胞悬液，裂解红细胞获得单个核细胞，用含10% FCS RPMI 1640培养孵育2 h，收集悬浮细胞即为同种异体淋巴细胞，调整浓度为1×106 mL1作为靶细胞置于96孔板(每孔100 μL)。收集各处理组的DCs分别加入丝裂霉素C(50 mg/mL)处理30 min，作为效应细胞。分别以效靶比(E/T)为1∶1、1∶10、1∶100加入，终体积为200 μL，每组设3个复孔，并分别设空白孔和单纯的淋巴细胞对照孔，培养3 d，与培养结束前4 h加入MTT液(5 mg/mL，每孔20 μL)继续孵育4 h，离心弃上清，加DMSO每孔 150 μL，避光，轻微震荡10 min，酶标仪测570 nm波长A值，结果取3孔均值，按下列公式计算刺激指数(stimulate index，SI)：

　　SI=实验组A/对照组A×100%

　　1.3 统计学处理 数据以x±s表示，采用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析。P<0.05为差别有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 RTPCR检测MyD88的表达 RNAi组[平均灰度比(0.247±0.051)]和对照组[平均灰度比(0.378±0.107)]与OK432组[平均灰度比(0.754±0.092)]相比，MyD88的表达明显降低，差别有统计学意义(P<0.05，图1)

　　M：Marker;1：对照组;2：OK432组;3：RNAi组.

　　图1 RTPCR检测各组树突状细胞MyD88 mRNA的表达

　　Fig 1 MyD88 mRNA expression in DCs measured by RTPCR

　　2.2 细胞因子的变化 RNAi组DCs较OK432组分泌的细胞因子TNFα、IL12显著降低，RNAi组和对照组与OK432组比较差别均有统计学意义(P<0.05，表1)。表1 3组树突状细胞分泌的细胞因子的浓度

　　2.3 混合淋巴细胞反应 OK432组DCs与对照组相比刺激同种异体T cell增殖的能力明显增强，而加入siRNA后DCs刺激T cell增殖的能力明显减弱，差别均有统计学意义(P<0.05，图2)。

　　3 讨 论

　　DCs作为机体功能最强的抗原提呈细胞，在抗感染免疫、抗移植排斥及肿瘤免疫等方面均具有重要作用，而TLRs及其信号途径在诱导DCs的成熟过程中起重要作用。TLRs能选择性识别病原微生物所携带的病原相关分子模式如LPS、肽聚糖、脂膜酸、细菌CpG DNA和细菌鞭毛蛋白，启动共同的信号途径通过激活转录因子如核因子κB和干扰素调节因子从而启动特异性免疫应答，诱导巨噬细胞和DCs的活化和成熟，在此过程中MyD88是关键的衔接分子，是启动下游信号转导的靶分子[811]。

　　OK432是链球菌Su株细胞壁的冻干制剂，具有激活多种免疫效应细胞的作用。Okamoto等认为，OK432是通过TLR4信号途径发挥其抗肿瘤作用的[12]。OK432通过吞噬作用进入DCs或巨噬细胞内，经溶酶体酶分解后释放出活性成分如OKPSA(一种脂磷壁酸相关分子)结合于TLR4，进而激活DCs，促进其成熟并释放大量Thl相关细胞因子。如IL12、TNFα等，使Th0细胞向Thl细胞分化，增强体内抗肿瘤效应。OK432是否通过MyD88途径介导DCs成熟尚不清楚，因此，本实验针对TLRs信号途径中的关键分子MyD88，采用化学合成的方法合成一对高效的MyD88 siRNA沉默MyD88的表达，观察其对OK432诱导DCs分泌的细胞因子和激活T细胞的影响。

　　研究结果一方面表明，由rmGMCSF 和rmIL4诱导的DCs经OK432进一步刺激后所分泌的细胞因子IL12和TNFα明显增多，刺激T细胞增殖能力显著增强，半定量RTPCR结果显示MyD88表达增强。TNFα具有杀伤肿瘤细胞和引起发热、炎症的作用，并且反过来可加速DCs的成熟[13]; DCs通过分泌IL12诱导Th0细胞分化为Th1细胞进而刺激T细胞活化增殖，产生细胞免疫应答。另一方面经MyD88 siRNA转染后再用OK432刺激，DCs中MyD88表达明显降低，说明siRNA转染成功;分泌的IL12和TNFα和刺激淋巴细胞增殖的能力亦均降低。表明MyD88 siRNA可抑制的合成并进一步抑制OK432诱导的DCs的成熟，增强了DCs 的免疫耐受作用，即MyD88介导OK432诱导DCs的成熟。虽然TLRs/ MyD88信号通路在抗自身免疫性疾病、抗移植排斥以及抗肿瘤免疫等方面的有较多研究，但以其为靶点进行疾病治疗的方法尚不完善，有待进一步研究。

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