As2O3对人恶性淋巴瘤CA46细胞系增殖、活力和细胞周期的影响及机制探讨

【摘要】 目的 探讨三氧化二砷(As2O3)对恶性淋巴瘤CA46细胞株增殖、活力和细胞周期的影响及机制探讨。 方法 磺酰罗丹明B(SRB)法观察不同浓度(0.625，1.25，2.5，5.0，10.0，20.0 μmol/L)As2O3分别处理24，48，72，96 h后CA46细胞系生长曲线，并计算上述各浓度As2O3处理72 h后CA46细胞系的细胞增殖抑制率;观察不同浓度(0.5，1.0，2.0 μmol/L)As2O3作用72 h后CA46细胞系的克隆形成率;流式细胞仪DNA倍体分析法探讨不同浓度(0.5，1.0和2.0 μmol/L)As2O3作用72 h对CA46细胞系细胞周期的影响;RTPCR法检测不同浓度(0.5，1.0和2.0 μmol/L)As2O3作用72 h后CA46细胞系p16基因mRNA的表达。同时设相应对照组进行比较。 结果 (1)与未处理组相比，各浓度As2O3均可明显抑制CA46细胞生长，且G0～G1期细胞逐渐增加，呈剂量依赖性。(2)未处理组细胞p16基因呈微弱表达，不同浓度As2O3作用72 h后，未处理组、不同浓度(0.5，1.0和2.0 μmol/L)As2O3处理组p16基因表达阳性条带灰度值与actin比值分别为(0.11±0.11)，(0.33±0.10)，(0.57±0.11)和(0.67±0.09)，各As2O3处理组p16基因mRNA表达明显高于未处理组，其差别有统计学意义(P<0.01)。 结论 As2O3可将细胞周期阻滞于G0～G1期，抑制肿瘤细胞的增长，其机制可能与诱导p16基因表达有关。

【关键词】 砷剂; 淋巴瘤; 细胞增殖; 肿瘤细胞，培养的; 细胞周期;基因，p16

　　 三氧化二砷(As2O3)是近年国内首先发现并被成功用于急性早幼粒细胞白血病(APL)等多种恶性血液病的诱导分化治疗的药物;它还被用于治疗慢性粒细胞白血病(CML)、多发性骨髓瘤等血液肿瘤及神经母细胞瘤等实体瘤，取得了很好的疗效，其报道的作用机制大多与诱导细胞的凋亡和分化有关。笔者拟以恶性淋巴瘤细胞株CA46为受试细胞株，以As2O3为实验药物，研究As2O3对人恶性淋巴瘤CA46细胞系增殖、活力和细胞周期的影响及可能的机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 药物 选用As2O3(哈尔滨医科大学第一医院产品)，以磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)配成1 mmol/L储存液，使用前用RPMI 1640溶液稀释至所需浓度。

　　1.2 细胞系及细胞培养 选用CA46，人恶性淋巴瘤(Burkitt淋巴瘤)细胞株，为福建省血液病研究所冷冻保存，复苏后用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养至所用细胞处于对数生长期。

　　1.3 实验分组 取对数生长期的CA46细胞，调整细胞浓度1×105 mL-1，接种于培养瓶中。生长曲线及细胞增殖抑制率实验设7组，即未处理组，As2O3(0.625，1.25，2.5，5.0，10.0，20.0 μmol/L)处理组;克隆形成率、细胞周期百分率、RTPCR实验设4组，即未处理组，As2O3( 0.5，1.0，2.0 μmol/L)处理组。用药后常规培养，培养过程不换液。

　　1.4 As2O3对CA46细胞增殖、活力和细胞周期的影响

　　1.4.1 测定As2O3对CA46细胞增殖的影响 参照文献[1]，使用全培养液将对数生长期CA46细胞稀释成1×105 mL-1单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板，每孔90 μL细胞悬液，加入不同浓度药物10 μL，培养后第24，48，72，96 h进行检测。细胞加药培养结束后，加入预冷的80%三氯醋酸溶液50 μL，静置5 min后再将平板移至4 ℃放置1 h。每孔加入4 g/L的SRB液100 μL，室温放置10 min，未与蛋白结合的SRB用1%醋酸洗5遍，每次300 μL，去除未与蛋白结合的SRB，空气干燥。用10 mmol/L非缓冲Tris碱液150 μL溶解未与蛋白结合的SRB，在酶标仪上用492 nm和630 nm双波长测吸光度值。

　　1.4.2 检测生长曲线与细胞增殖抑制率 用药后第24，48，72和96 h用SRB法检测每个实验组的平均OD值，以吸光度值为纵轴，作用时间为横轴绘制生长曲线。取72 h的OD值，比较各组的细胞增殖抑制率，以As2O3浓度为横轴，抑制率为纵轴绘制曲线，由此求出细胞生长抑制50%时的As2O3浓度，即IC50。实验至少重复3次。

　　各加药组细胞增殖抑制率=(未处理组OD值-各加药组OD值)/未处理组OD值×100%。

　　1.4.3 计算克隆形成率 CA46细胞经不同浓度药物作用72 h后，洗去药物，用含20%小牛血清的RPMI 1640完全培养液稀释为7.0×103 mL-1单细胞悬液。于24孔塑料培养板预加1.2%甲基纤维素培养基，每孔1.0 mL，加入上述单细胞悬液50 μL，使每孔细胞数为350个。每个浓度设3个复孔。混匀后置37 ℃、体积分数为0.05的CO2、饱和湿度的培养箱中孵育10～12 d。于倒置显微镜下计数细胞克隆数，以>40个细胞数为1个克隆，计算克隆形成率(平均克隆数/350×100%)，实验重复3次。

　　1.4.4 检测细胞周期百分率 按Cycle Test Plus DNA Reagent Kit(美国 Becton Dickinson公司)说明书操作，分别收集0.5，1.0，2.0 μmol/L As2O3处理72 h后的细胞和未处理组的细胞。离心沉淀后用0.067 mol/L的PBS洗涤2次。吸取上清，留约50 μL残留液体，加1 mL Buffer Solution轻吹打重悬细胞。室温下1 800 r/min离心5 min。重复第2，3步骤2次。用Buffer Solution调整细胞浓度为1×106 mL-1。室温下2 000 r/min离心5 min，吸取上清。每份标本加250 μL Solution A，轻混匀，室温下孵育10 min。加入200 μL Solution B，轻混匀，室温下孵育10 min。加入200 μL冷(4～8 ℃)Solution C，轻混匀，避光，2～8 ℃孵育10 min。置于冰上，避光，用FACSCAN流式细胞仪(美国BD公司)检测。

　　1.5 检测p16基因的表达 分别收集0.5，1.0，2.0 μmol/L AS2O3处理72 h后的细胞和未处理组的细胞，用Trizol法提取CA46细胞RNA，用逆转录试剂盒(日本Takala公司)进行反转录后使用特异性引物(表1)进行PCR扩增。将产物电泳后于凝胶成像分析仪上自动分析图像，使用专用分析软件对目的基因与βactin的灰度比进行半定量分析。表1 PCR引物序列、产物长度及退火温度

　　1.6 统计学处理 采用SPSS 10.0统计软件，As2O3处理组采用单因素方差分析;未处理组与加药组均数的两两比较采用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 As2O3对CA46细胞生长、增殖及活力的影响

　　2.1.1 细胞生长曲线及细胞增殖抑制率 As2O3显著抑制CA46细胞的生长，延长细胞倍增时间，不同浓度的As2O3作用细胞后，活细胞数发生变化，这种变化呈剂量依赖性(图1)。与未处理组比较，不同浓度As2O3(0.625，1.25，2.5，5.0，10.0，20.0 μmol/L)作用72 h后，细胞增殖抑制率分别为(32.1±0.03)%，(56.0±0.04)%，(77.0±0.01)%，(89.2±0.02)%，(89.0±0.02)%，(91.1±0.04)%。未处理组和各加药组比较，差别有统计学意义(P<0.01)。图1 各As2O3处理组CA46细胞的生长曲线

　　Fig 1 Influence of As2O3 on CA46 cell line

　　2.1.2 As2O3抑制CA46细胞的克隆形成 由以上细胞增殖抑制实验结果得出72 h IC50约为1.1 μmol/L，取与之接近的1 μmol/L为克隆形成实验中心浓度，分别设2.0，1.0和0.5 μmol/L三个药物浓度组和未处理组进行比较。细胞克隆形成抑制实验表明：As2O3抑制CA46细胞的克隆形成，并呈剂量依赖性。不同浓度As2O3处理组克隆形成率均低于未处理组，未处理组及0.5，1.0，2.0 μmol/L As2O3处理组克隆形成率依次为(48.6±1.3)%，(37.1±0.8)%，(31.4±1.8)%、0和0，未处理组和各加药组比较，差别有统计学意义(P<0.05)。倒置显微镜下观察，未处理组细胞呈细胞团致密生长;加药组细胞生长分散、平铺。

　　2.2 As2O3抑制CA46细胞周期转换 随着As2O3浓度增加，不同浓度的As2O3加药组的G0及G1期细胞百分数高于未处理组，差别有统计学意义(P<0.01，表2，图2)

　　2.3 As2O3处理CA46细胞72 h后p16基因mRNA的表达 未处理组见微弱表达，0.5 μmol/L处理组可见弱表达，随药物浓度增加，p16表达增强，正常淋巴细胞为阳性对照(图3)。经图像分析仪显示，未处理组、不同浓度(0.5，1.0和2.0 μmol/L)As2O3处理组阳性条带灰度值与βactin比值分别为(0.11±0.11)，(0.33±0.10)，(0.57±0.11)及(0.67±0.09)，阳性对照灰度比值为(0.73±0.13)(P<0.01)。表2 不同浓度As2O3对CA46细胞周期的影响

　　3 讨 论

　　As2O3近年来被成功用于APL、CML等血液肿瘤及神经母细胞瘤等实体瘤，取得了很好的疗效，其作用机制多为诱导细胞的凋亡和分化[35]。三价砷进入人体后在肝脏被还原发生甲基化，形成一甲砷酸和二甲砷酸而解毒，砷代谢所需甲基来自S腺苷蛋氨酸，砷与含相邻巯基的化合物结合而发挥效应，与含巯基酶结合后，抑制酶的活性，干扰酶的生理功能，谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸、二巯基化物如二巯基丙醇等，可抵抗As2O3的毒性作用，表明As2O3的毒理学是源于对诸多酶的巯基族的可逆性结合。目前研究较多的是As2O3、有机砷——美拉砷醇及四硫化四砷(As4S4，雄黄的主要成分)等。

　　本研究所选用细胞株CA46为B细胞淋巴瘤细胞株，其p16基因启动子CpG岛高度甲基化[6]，故该基因仅呈微弱表达。实验结果表明，当As2O3浓度为0.5 μmol/L时，克隆形成率下降约10%，SRB法检测0.625 μmol/L药物处理72 h细胞抑制率约为32%，随着As2O3浓度增加，CA46细胞受抑程度明显增加;即小剂量的As2O3体外即能够抑制CA46细胞增殖，降低细胞活力，并呈剂量依赖性。进一步研究发现，As2O3主要使恶性淋巴瘤细胞阻滞于G0～G1期，因此，笔者认为，As2O3作用于肿瘤细胞增殖周期的不同阶段而发挥抗肿瘤作用，这可能是其药理机制之一。G1～S作为细胞周期最重要的调控点，受许多细胞周期调控因子的调控。参与细胞周期调控的因子主要有：细胞周期蛋白(cyclin)、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKI)。其中，CKI通过在细胞周期适当时间点上抑制CDK的活性从而在细胞周期进程中起着重要的负调控作用。P16基因(INK4A/MTS1/CDKN2)就是CKI家族的重要成员，在细胞周期调控中，构成p16/p15、CDK4/6、cyclin D、Rb途径。CDK4通过与cyclin D1结合而被激活，从而使Rb蛋白发生磷酸化;Rb的磷酸化使被其抑制的E2F等转录因于释放，G1/S期转换促进因子表达增加，从而使细胞周期通过G1/S期限制点进入S期;笔者发现As2O3可提高CA46细胞p16基因表达水平，因p16蛋白与CDK4、CDK6结合后相互作用，抑制CDK4和CDK6结合到cyclin D，导致细胞周期停止在G1期。

　　DNA甲基化、染色体结构改变都属于表观遗传学的改变，在肿瘤的发生、发展中有着重要的作用。这些都与转录关键细胞调节基因抑制有关[7]。已有研究显示，恶性淋巴瘤、白血病等多种肿瘤中DNA甲基化都是抑癌基因失活的主要原因并与预后有关[89]。Siu等检查33例自然杀伤细胞淋巴瘤，发现63%p16基因发生甲基化，这可能提示淋巴瘤的发生和p16基因甲基化存在着一定的相关性[10]。小剂量的As2O3体外即能够明显抑制CA46细胞增殖，使其阻滞于G0～G1期，并使p16基因表达增高，可能是因As2O3在体内可被还原形成一甲砷酸和二甲砷酸而解毒，还原过程需要甲基，使抑癌基因甲基化受阻，从而干扰体内的DNA甲基化模式，发挥去甲基化作用。提示As2O3可能用于恶性血液病的逆转甲基化治疗。

参考文献

1] Fukuda K，Hibiya Y，Mutoh M， et al. Inhibition of activator protein 1 activity by berberine in human hepatoma cells[J]. Planta Med， 1999，65(4):381383.

　　[2] Porosnicu M，Nimmanapalli R，Nguyen D， et al. Cotreatment with As2O3 enhances selective cytotoxic effects of STI571 against BcrAblpositive acute leukemia cells[J]. Leukemia， 2001，15(5):772778.

　　[3] Sordet O，Wrebe C，Leroy I， et al. Mitochondriatargeting drugs arsenic trioxide and Lonidamine by pass the resistance of TPAdifferentiated leukemic cells to apoptosis[J]. Blood， 2001，97(12):39313940.

　　[4] 苏 颖，邹长棪，陈 增，等. 三氧化二砷及干扰素联用对K562及K562/ADM耐药细胞系的作用[J]. 福建医科大学学报， 2003，37(2):155157.

　　[5] 战 榕，俞庆宏，黄豪博，等. 三氧化二砷抑制U266细胞增殖、诱导凋亡及与血管内皮生长因子表达的关系[J]. 福建医科大学学报， 2007，41(6):491494.

　　[6] 周华蓉，沈建箴，付海英，等. 巢式MSP法检测恶性血液病细胞株p16基因启动子甲基化状态的研究[J]. 中国实验血液学杂志， 2006，14(2):375378.

　　[7] Allen A. Epigenetic alterations and cancer: new targets for therapy [J]. Drugs， 2007，10(10):709712.

　　[8] RomanGomez J，JimenezVelasco A，Barrios M， et al. Poor prognosis in acute lymphoblastic leukemia may relate to promoter hypermethylation of cancerrelated genes[J]. Leuk Lymphoma， 2007，48(7):12691282.

　　[9] RomanGomez J，JimemezVelasco A，A girre X， et al. Repetitive DNA hypomethylation in the advanced phase of chronic myeloid leukemia[J]. Leuk Res， 2008，32(3):487490.

　　[10] Siu L L，Chan J K，Wong K F， et al. Specific patterns of gene methylation in natural killer cell lymphomas: p73 is consistently involved[J]. Am Pathol， 2002，160(1):5966.