细胞间黏附分子1 K469E基因多态性与糖尿病视网膜病变的关系

　　　　 作者：朱捷， 高适华， 池细俤， 张友胜， 赖小铮， 钟文亮

【摘要】 　　目的 探讨细胞间黏附分子1（ICAM1）469K/E基因多态性与糖尿病视网膜病变（DR）的关系。 方法 收集2型糖尿病无DR患者40例、2型糖尿病DR患者40例和对照者30例抗凝血。分离白细胞，以DNAzol抽提白细胞总DNA。分别采用基于BStUI酶切位点的PCR限制性长度多态性（PCRRFLP）及等位基因序列特异性引物PCR法检测469K/E基因多态性。等位基因和基因型频率比较采用χ2检验。 结果 PCRRFLP及等位基因序列特异性引物PCR法检测469K/E基因多态性获得的结果完全吻合。2型糖尿病DR患者ICAM1 469 KE及EE基因型出现的频率显著高于2型糖尿病无DR患者及对照组(P<0.01)，2型糖尿病DR患者等位基因E出现的频率明显高于无DR患者及对照组(P<0.01)。 结论 ICAM1 469E等位基因与2型糖尿病视网膜病变有关。

【关键词】 胞间黏附分子1； 糖尿病视网膜病变； 多态性，限制性片段长度； 聚合酶链反应

　　ABSTRACT: Objective To investigate the relationship between diabetic retinopathy and K469E gene polymorphism of intracellular adhesion molecule1(ICAM1). Methods 40 cases of type 2 diabetes mellitus patients with and without retinopathy， 30 cases of normal controls were enrolled. Anticoagulated blood was collected， and genome DNA was extracted from isolated white blood cells by DNAzol reagents. The K469E gene polymorphism of ICAM1 was detected by BStUI restriction sitebased polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism (PCRRFLP) and allele sequencespecific primer PCR. Allele and genotype frequencies were analyzed by the χ2 test. Results Results from PCRRFLP and allele sequencespecific primer PCR assay were consistent with each other. ICAM1 469 KE and EE genotypes were significantly higher in type 2 diabetes mellitus patients with retinopathy than those without retinopathy and the control group (P<0.01)， the frequency of alleles E in type 2 diabetes mellitus patients with retinopathy was apparent higher than that in patients without retinopathy and the control group (P<0.01). Conclusion K469E gene polymorphism of ICAM1 is related with the diabetic retinopathy.
　　
　　KEY WORDS: intercellular adhesion molecule1; diabetic retinopathy; polymorphism， restriction fragment length; polymerase chain reaction

　　糖尿病视网膜病变（diabetes retinopathy，DR）是糖尿病最为常见和严重的微血管并发症之一，是糖尿病致盲的主要原因。已知糖尿病患者血管内皮细胞受损与DR发生紧密相关。大量研究表明，黏附分子介导的白细胞与内皮细胞的相互作用在内皮损伤的发生中占重要地位。作为黏附分子中重要成员，细胞间黏附分子1（intracellular adhesion molecule1，ICAM1）与DR关系目前受到广泛重视。笔者运用PCR相关技术，观察ICAM1 469K/E基因多态性与DR之间的关系，进而评估该基因多态性在DR中的可能作用，探讨DR发生的危险因素。

　　1 对象和方法

　　1.1 对象

　　收集2型糖尿病无DR患者40例、2型糖尿病DR患者40例和对照者30例抗凝血。糖尿病的诊断根据1999年世界卫生组织颁布的糖尿病诊断标准，糖尿病视网膜病变诊断根据1984年第一届全国眼底病会议制定的标准，直接检眼镜检查及眼底荧光血管造影确诊，排除其它原因所致视网膜血管增生、出血等。

　　1.2 试剂与仪器

　　DNAzol（美国Invitrogen公司）；PCR回收试剂盒、胶回收试剂盒及Taq酶（美国Promega公司）；限制性核酸内切酶BstUI（美国NEB公司）。引物由上海超世生物科技有限公司合成，其他试剂为国产分析纯。PCR仪（AB2720型，美国ABI公司）。

　　1.3 方法

　　1.3.1 白细胞DNA提取

　　2 mL ACD(0.45% 柠檬酸，1.32% 柠檬酸钠，1.47% 右旋葡萄糖)抗凝血加入10 mL红细胞裂解液（8% 氯化铵，1% 碳酸氢钾，0.37% 乙二胺四乙酸二钠），颠倒混匀后置4 ℃ 30 min。2 000 r/min离心10 min，弃上清。沉淀的白细胞中加入DNAzol 1 mL，反复吹打裂解细胞，10 000 r/min离心10 min，收集上清，加入无水乙醇0.5 mL。于4 ℃，10 000 r/min离心10 min，DNA沉淀以75 %乙醇洗涤2遍后溶于200 μL双蒸水。

　　1.3.2 PCRRFLP DNA样本行PCR扩增，根据ICAM1基因序列设计引物（序列号NT_011295），序列为：
　　
　　上游:5’CCCATTGCCCGAGC3’
　　
　　下游:5’TGAGGATTGCATTAGGTC3’

　　反应体系为：总体积25 μL，含Taq聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，10×PCR缓冲液2.5 μL，10×dNTP 0.5 μL，上游引物（10 pmol/μL）0.75 μL，下游引物0.75 μL，白细胞DNA 0.5 μg。反应程序为：94 ℃预变性2 min→94 ℃ 30 s→55 ℃ 30 s→72 ℃ 1 min(共30循环)；末次循环后延伸5 min。取扩增产物2 μL，以2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
　　
　　PCR产物以胶回收试剂盒回收，溶于25 μL双蒸水。取10 μL回收DNA以1 μL（10 U）BstUI进行酶切，酶切产物以2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

　　1.3.3 等位基因序列特异性引物PCR 引物参照文献[1]合成，序列为：
　　
　　引物1:5’GGGGCTGTGGGGAGGATA3’
　　
　　引物2:5’CCCCGACTGGACGAGAGG3’
　　
　　引物3:5’CACATTCACGGTCACCTC3’
　　
　　引物4:5’CACATTCACGGTCACCTT3’
　　
　　其中引物3及引物4为基因序列特异性。以引物1及引物2进行第1轮PCR扩增，反应总体系25 μL，10×缓冲液2.5 μL，10×dNTP 0.5 μL，上游引物（10 pmol/μL）0.75 μL，下游引物0.75 μL，白细胞DNA 0.1 μg。反应条件:94 ℃ 预变性4 min→94 ℃变性 30 s→58 ℃退火 30 s→72 ℃延伸 1 min，循环 30次，末次循环后延伸7 min，扩增产物以PCR回收试剂盒回收，溶于50 μL双蒸水。
　　
　　取1 μL回收产物作为模板进行第2轮PCR扩增。反应总体系25 μL，其中含Taq聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，10×缓冲液2.5 μL，10×dNTP 0.5 μL，引物1（10 pmol/μL）0.75 μL，引物3或引物4（10 pmol/μL）0.75 μL。反应条件：94 ℃预变性2 min→94 ℃变性45 s→54 ℃退火15 s→72 ℃延伸 45 s，循环20次，末次循环后延伸7 min。PCR产物以2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

　　1.4 统计学处理
　　
　　采用SPSS 13.0统计软件包，基因频率采用直接计数法，等位基因和基因型频率比较采用χ2检验。

　　2 结果

　　2.1 PCRRFLP结果

　　PCR扩增的ICAM1基因片段总长223 bp，位于第13 848碱基附近（第六外显子）。野生型ICAM1基因第13 84813 850碱基(AAG)编码赖氨酸(K)，若13 848碱基突变为G，则编码谷氨酸（E），为K469E突变型。该突变产生BStUI酶切位点。因此，野生型（KK型）PCR产物对BStUI酶切无反应，但K469E纯合子突变型（EE纯合型）的PCR产物经BStUI酶切后产生两个片段，分别为136 bp和87 bp，K469E杂合子突变型（KE杂合型）的PCR产物经BStUI酶切后产生3个片段，分别为223 bp，136 bp，87 bp（图1）。

　　在40例2型糖尿病DR患者中，检出6例EE纯合子突变基因型，24例KE杂合子突变基因型。在40例2型糖尿病无DR患者中，检出2例EE纯合子突变基因型，14例KE杂合子突变基因型。在30例对照者中，检出1例EE纯合子突变基因型，8例KE杂合子突变基因型（表1）。表1 ICAM1基因 469K/E 基因型和等位基因频率的分布（略）Tab 1 Distribution of 469K/E genotypes and allele frequencies of ICAM1 gene（略）。

　　2.2 等位基因序列特异性引物PCR结果

　　第1轮PCR扩增的ICAM1基因片段总长331 bp，根据第2轮扩增产物进行基因型分析：若为野生型（KK型）， 利用引物1和4可扩增出237 bp产物，而引物1和3无扩增产物；若为K469E杂合子突变型（KE杂合型），引物1和4或3均可扩增出237 bp产物；若为K469E纯合子突变基因型（EE纯合型），引物1和3可扩增出237 bp产物，引物1和4无扩增产物（图2）。本法检测KE杂合子突变型、EE纯合子突变基因型及KK野生型种类和例数与PCRRFLP结果100%吻合。

　　2.3 ICAM1基因型和等位基因频率比较

　　2型糖尿病DR患者ICAM1 469 KK、KE及EE基因型出现的频率与2型糖尿病无DR患者及对照组比较差别有统计学意义(P<0.01)。其中，KE及EE基因型在2型糖尿病DR患者显著增高，KK基因型显著降低。K、E等位基因频率在不同组别中的分布也存在明显差异，2型糖尿病DR患者等位基因E出现的频率明显高于无DR患者及对照组(χ2=15.99，P<0.01，表1)。

　　3 讨论
　　
　　ICAM1是最早发现的免疫蛋白超家族黏附分子之一[2]，为单链跨膜糖蛋白，核心多肽为55 kDa。ICAM1分子分布主要表达于内皮细胞、上皮细胞及淋巴细胞等表面，通过与LFA1分子结合，介导抗原提呈细胞与T细胞、T细胞与靶细胞黏附及细胞间信息传递，在炎症和免疫反应中起重要作用。
　　
　　人类ICAM1基因位于染色体19p13.2p13.3上，为单拷贝基因，含7个外显子和6个内含子，第6外显子编码产物与结合LFA1有关。第6外显子469密码子存在基因多态性，即有K、E两个等位基因和KK、KE、EE三种基因型。近年来的研究表明，ICAM1基因第6外显子469密码子多态性与心脑血管病变存在显著的相关性。Longoni等发现，K469E多态性与自发性颈动脉分离症脉堵塞性疾病有关[3]，Pola等发现GG基因型IL2基因与EE基因型ICAM2基因具有协同作用，明显增加缺血性脑卒中的危险性[4]。国内相关研究也提示，ICAM1基因K469E多态性与中国人脑梗死、冠心病及心绞痛的发病具有相关性[57]。
　　
　　DR是糖尿病最常见及最主要的微血管并发症之一，分为非增生性和增生性，前者以血管膨胀、微动脉瘤（血管变弱）、视网膜出血为特征；后者以新血管形成为显著特征。DR病因复杂，近年来的研究表明炎症反应及ICAM1在内的细胞因子在其中起重要重要作用[8]。本研究旨在探讨ICAM1 K469E基因多态性与2型糖尿病DR的相关性。该位点的检测一般通过PCRRFLP或等位基因序列特异性引物PCR进行，为使研究结果更为可靠，本研究同时采用这两种方法进行检测，结果表明这两种方法具有很好的相似度。进一步的分析提示，2型糖尿病DR患者ICAM1 KE与EE基因型频率及E等位基因频率明显高于无DR患者及对照组，提示ICAM1 K469E基因多态性与2型糖尿病DR的发生有关。此外，本研究结果与Petrovic等人进行的高加索人种的研究结果相似，提示ICAM1 K469E基因多态性与2型糖尿病DR的关系在不同人种中均存在[9]。
　　
　　一般认为，中性粒细胞与内皮细胞通过ICAM1介导牢固黏附，使中性粒细胞大量释放的自由基等活性物质直接损伤内皮并导致内皮功能障碍。ICAM1基因 K469E多态性可能导致了薄膜外区域（D1及D2）的氨基酸序列改变，影响其与中性粒细胞表面受体LFA1的相互作用，进而影响ICAM1相关疾病的发生、发展及转归[10]，本研究再次证实ICAM1 K469E基因多态性与2型糖尿病DR的发生有关，但其确切机制有待进一步深入研究。

参考文献

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　　[9] Petrovic M G，Osredkar J，SaragaBabic M，et al. K469E polymorphism of the intracellular adhesion molecule 1 gene is associated with proliferative diabetic retinopathy in Caucasians with type 2 diabetes[J]. Clinical and Experimental Ophthalmology，2008，36(2): 468472.

　　[10] 李猛，高春记. LFA1与配体ICAM1黏附分子功能的研究进展[J]. 中国实验血液学杂志， 2008，16(1):79.