神经干细胞移植对脊髓损伤后大鼠行为和神经组织学的影响

【摘要】 目的 观察神经干细胞移植对脊髓损伤后大鼠行为和神经组织学的影响。 方法 建立脊髓损伤动物模型，脊髓内注射神经干细胞，采用改良Gale联合评分法评价神经功能，通过HE染色及尼氏体染色观察脊髓灰白质及神经元的组织学改变。 结果 脊髓损伤神经干细胞移植组大鼠感觉、运动功能恢复明显(P<0.05);灰、白质中出现小片状出血，神经元肿胀、破裂、溶解，尼氏小体减少程度较脊髓损伤组轻，损伤坏死区胶质细胞较脊髓损伤组增多(P<0.05)。 结论 使用神经干细胞移植能减轻神经细胞坏死程度，减轻脊髓损伤，并使损伤坏死区胶质细胞增多，促进脊髓损伤的修复，对脊髓损伤大鼠感觉、运动功能的恢复有促进作用。

【关键词】 神经元，干细胞; 脊髓损伤; 组织学; 疾病模型，动物

　　　　 脊髓损伤(spinal cord injury， SCI)是临床上常见的疾病，致残率高，治疗效果不理想，多以不全瘫或全瘫为结局，严重影响患者的生活质量。因此SCI后功能恢复的研究一直是神经科学研究的难点和热点。近年来，神经干细胞(neural stem cells， NSC)的移植给SCI后治疗带来新的希望。NSC具有多潜能、自我复制和更新、未分化等特征。本研究通过在损伤脊髓的局部移植NSC，观察行为学和组织学方面的变化，初步探讨NSC对损伤脊髓局部神经细胞的影响及其表达功能的调节。

　　1 动物与方法

　　1.1 动物与仪器试剂 SpragueDawley(SD)大鼠(SCXK闽2004002)70只，体质量(200±20)g，雌雄不限。生物显微镜(BX40型，日本Olympus公司);立体定位仪(江湾C型，上海第二军医大学);微量注射器(1 μL，美国Sigma公司);组织切片机(Leica2135型，德国)。脱毛剂：8%硫化钠水溶液;10%甲醛水溶液;1%伊红水溶液;10%苏木素;缓冲亚甲蓝染液;0.2%醋酸盐缓冲液;4%钼酸铵液;NSC(由福建医科大学分子医学211工程实验室提供)漂洗3次，含量为105 μL-1。

　　1.2 方法

　　1.2.1 分组 大鼠随机分3组：(1)对照组10只，仅暴露硬脊膜。(2)SCI组30只，用3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，俯卧位固定，显露T9T11棘突，咬除T10棘突及椎板，暴露硬脊膜，应用Allen打击法致SCI，打击势能50 gcm，损伤部位注射等量生理盐水，并于SCI后2、5、12 d各取10只大鼠处死，取SCI部位上下各4 mm脊髓，行HE染色和神经尼氏体染色。(3)NSC移植组30只，于SCI后即刻注射NSC。注射时用微量注射器吸取NSC 1 μL，应用立体定位仪于T10平面脊髓后动脉旁开0.5 mm注射，深度1 mm，5 min内注射完毕，留针3～5 min，并于注射NSC后2、5、12 d各取10只大鼠处死取材，取材范围及染色方法同SCI组。

　　1.2.2 行为学及组织学观察 神经功能评价标准采用改良Gale联合评分法(改良CBS法)[1]。检测项目是：开放空间运动能力、脚趾伸展、触地反应、回缩反射、矫正反射、斜板试验及游泳试验。评分以正常为100分，后肢全瘫为0分。常规HE染色，光镜观察脊髓出血、水肿等;神经尼氏体采用Pischingert氏亚甲蓝染色法，光镜观察神经细胞肿胀、变性、坏死及尼氏小体变化等。

　　1.3 统计学处理 数据以x±s表示，采用SPSS 10.0软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 行为学观察结果 NSC移植组大鼠感觉、运动功能恢复明显，与SCI组及对照组比较，差别有统计学意义(P<0.05，表1)。

　　2.2 SCI前后及NSC移植后组织学变化 SCI组于SCI后2 d，脊髓灰、白质中出现片状出血，神经元肿胀、破裂、溶解，尼氏小体减少甚至消失，且随距损伤处距离的延长而逐渐减轻;于SCI后5 d，损伤坏死区有胶质细胞增生，伤后12 d增生更加明显(图1)。表1 大鼠改良CBS评分与脊髓损伤组比较，△：P<0.05;与对照组比较，☆：P<0.05.NSC移植组损伤后2 d，灰、白质中出现小片状出血，神经元肿胀、破裂、溶解，尼氏小体减少程度较SCI组轻;损伤后5 d及12 d，损伤坏死区胶质细胞均较SCI组增多(图2)。

　　3 讨 论

　　SCI是一种常见而严重的临床疾患。我国发病率约每年6.7人/百万人，以中青年胸腰段损伤最多。常导致患者损伤平面以下感觉、运动功能减退

　　A～D：脊髓损伤后2 d(A：×40;B～D：×400);灰、白质中出现片状出血，神经元肿胀、破裂、溶解，尼氏小体减少甚至消失，且随距损伤处距离的延长而逐渐减轻;E：脊髓损伤后5 d(×100)，损伤坏死区有胶质细胞增生;F～G：脊髓损伤后12 d组(F：×100;G：×400);损伤坏死区有胶质细胞增生更加明显. A、B、C、E、F：HE染色;D、G：Pischingert氏亚甲蓝染色.

　　图1 脊髓损伤组的组织学变化

　　Fig 1 Histological changes in the spinal cord injury control group

　　A～B：神经干细胞移植后2 d (A：×40;B：×400)，灰、白质中出现小片状出血，神经元肿胀、破裂、溶解，尼氏小体减少程度较脊髓损伤组轻;C：神经干细胞移植后5 d (×100)，损伤坏死区胶质细胞较脊髓损伤组增多;D～E：神经干细胞移植后12 d (D：×100;E：×400)，损伤坏死区胶质细胞较脊髓损伤组增多. A、C、D：HE染色;B、E：Pischingert氏亚甲蓝染色.

　　图2 神经干细胞移植组的组织学变化

　　Fig 2 Histological changes in t the spinal cord injury stem cell group

　　或丧失、植物神经功能紊乱、大小便失禁等[2]。致残率高，治疗效果往往不理想，多以不全瘫或全瘫为结局，严重影响患者的生活质量。近年来，在基础研究领域，细胞移植治疗SCI已成为促进其受损组织修复及功能重塑的重要手段[3]。在可供移植的种子细胞中，NSC以其良好的自我更新增殖能力及多向的分化潜能而成为最具前景的研究热点之一[4]。随着NSC的发现和分离成功，尤其是NSC可以在体外大量培养、增殖以及干细胞系的建立可以大量提供神经元和胶质细胞，为损伤后进行替代治疗提供了充分的材料。

　　本研究采用的SCI模型：(1)SCI节段的选择：因为动物胸段脊髓处椎板咬除方便，且能避开骶髓排便中枢以便术后管理，但SCI节段越高，损伤后动物死亡率亦越高，故选择胸段作为损伤节段，以T8～T12为宜。本实验采用T9～T11作为损伤节段。(2)采用改良Allen打击法致伤中胸段脊髓，其优点在于与人类SCI的相关性好，保持了硬脊膜的完整性，可有效防止外源性成分侵入SCI区域，防止脊髓外露与脊液外漏[5]。

　　NSC来源于胚胎早期室管膜上皮，具有多向分化的潜能。NSC具备自我更新和增殖的能力，可在特定因素影响或诱导下，向神经元或胶质细胞分化。大量研究表明，NSC移植入损伤脊髓后，不仅能在损伤信号存在的情况下向损伤原位迁移，并被诱导分化成神经元、神经胶质细胞，起到组织学上的直接替代作用，还可通过持续分泌广泛的神经营养因子，促进神经元存活和轴突生长及延伸[610]。Martinezserrano等报道，将NSC作为细胞系培养转导后移植到脊髓受损区，移植细胞存活、整合、分化为神经元和胶质细胞，阻断了神经元变性，促进了脊髓功能部分恢复[11]。NSC移植方法有直接移植法、静脉注射移植法和蛛网膜下腔注射移植法等。本研究采用直接移植法，具有以下优点：(1)NSC直接移植到损伤区域，避免NSC在静脉血液或脑脊液迁移过程中各种因素的干扰，影响实验结果;(2)NSC直接移植到损伤区域，缩短了其他移植方法中NSC到达损伤区域的时间，起到组织学上的直接替代作用;(3)实验中用的NSC量较静脉注射移植法和蛛网膜下腔注射移植法少，节省成本。本研究结果显示，在组织学方面，NSC移植组在SCI第2、5、12天，神经细胞坏死程度及尼氏小体减少程度均较SCI组减轻，而损伤坏死区胶质细胞则比SCI组增多;在行为学方面，NSC移植组在各个不同时间点(SCI后第1、3、6、9天和第12天)，综合多项观察指标的评分均明显高于损伤对照组。提示SCI后通过移植NSC能减轻局部神经组织受损程度，并且能使胶质细胞增生，进而改善SCI大鼠的神经功能，促进SCI的修复，在动物水平验证了NSC在急性SCI期应用的可行性与有效性，也为进一步探讨NSC移植修复SC

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