二氮嗪预处理对缺氧复氧后大鼠海马神经元凋亡及JNK表达的影响

　　　　　　 作者：刘荣国， 崔翔， 宋娜， 陈彦青

【摘要】 目的 探讨二氮嗪(DZ)预处理能否抑制CJun氨基末端激酶(JNK)表达而减轻缺氧复氧后大鼠海马神经元的凋亡。 方法 原代培养9～10 d的SD大鼠海马神经元随机分为5组：对照组、DZ 0，30，100 μmol/L和DZ 100 μmol/L+5羟癸酸(5HD)100 μmol/L预处理组。除对照组外，其余4组神经元自缺氧前2 d开始，每天实施以上对应浓度DZ预处理1 h，连续3 d。于体外缺氧4 h复氧48 h后，采用四唑蓝比色法测定海马神经元活力，AnnexinⅤFITC流式细胞术测定凋亡率，Western blotting法检测JNK蛋白表达。 结果 与对照组比较，缺氧复氧后海马神经元的活力下降，凋亡率增大，JNK蛋白表达增强(P<0.05)。与其他预处理组比较，DZ 100 μmol/L预处理组的神经元活力高，凋亡率低(P<0.05)，其他预处理组间比较无统计学意义。DZ预处理后，JNK蛋白表达减低，且DZ 100 μmol/L组表达弱于DZ 30 μmol/L组(P<0.05)。同时给于5HD预处理后，DZ未能抑制JNK蛋白表达。 结论 DZ预处理可能抑制JNK表达而减轻缺氧复氧后大鼠海马神经元的凋亡。

【关键词】 二氮嗪; 海马; 疾病模型，动物; 缺氧缺血，脑; 神经元; 细胞凋亡; JNK丝裂原活化蛋白激酶类

　　　　 以二氮嗪(Diazoxide，DZ)为代表的线粒体内膜上ATP敏感钾通道(Mitochondrial ATP Sensitive Potassium Channel， MitoKATP)开放剂可模拟缺血预处理，激发脑的内源性保护机制而增强抗损伤效果[12]。脑损伤患者的愈后与凋亡密切相关。cJun氨基末端激酶 (cJun Nterminal kinase，JNK)是有丝分裂原激活蛋白激酶超家族成员之一，具有促凋亡和抗凋亡的双重功能，发挥哪一功能受到细胞类型、刺激方式、持续时间以及其他信号的影响，在离体培养大鼠海马神经元缺氧实验中，JNK信号主要发挥促凋亡作用[34]。本研究以原代培养的大鼠海马神经元为实验对象，探讨DZ预处理能否抑制JNK信号蛋白表达而减低缺氧复氧后大鼠海马神经元的凋亡，旨在进一步了解药物预处理的抗损伤机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要药品、试剂和仪器 二氮嗪(批号：022K1516)、5羟癸酸(5Hydroxydecanoate，5HD，批号：057H5076)购自美国Sigma公司;Annexin ⅤFITC试剂为美国BD公司产品;多克隆兔抗大鼠JNK抗体(FL型SC57)、山羊抗兔IgG抗体购自美国Santa cruz公司。密闭缺氧装置为北京通达科技公司产品;电泳仪(MiniProtean3，美国Amersham Biosciences公司);酶标仪(Model 550，美国BioRad公司);凝胶成像系统(Gel Doc XR+，美国BioRad公司);流式细胞仪(FACS Calibur，美国BD公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 大鼠海马神经元原代培养和鉴定 取新生SD大鼠〔出生时间<24 h，5～6 g，二级，上海实验动物中心提供(许可证号：SCXK沪20070005)〕，经消毒、断头后分离出海马，切碎并移入0.125%胰蛋白酶溶液中消化30 min。终止消化，吹打细胞悬液，以5×105 mL1的细胞密度接种于直径35 mm培养皿或96孔板中，每皿2 mL或每孔100 μL，置于37 ℃、体积分数为0.1的CO2培养箱中培养，9～10 d后行实验。神经元鉴定方法为：培养至第9天，应用神经元特异性烯醇化酶(Neuron Specific Enolase，NSE)免疫细胞化学染色，海马神经元细胞质和突起被染成棕褐色，为阳性细胞;未被染色的细胞为阴性细胞。

　　1.2.2 实验分组、缺氧方法和DZ预处理方法 大鼠海马神经元分为对照组(A组)、DZ 0 μmol/L组(B组)、DZ 30 μmol/L组(C组)、DZ 100 μmol/L组(D组)、DZ 100 μmol/L+5HD 100 μmol/L(E组)。每次实验每组采用12孔或2皿，实验重复3次。除对照组外，其他组于缺氧前2 d开始，每天实施以上对应浓度DZ预处理，每次1 h，随后培养液全量置换，连续3 d。将海马神经元置入密闭缺氧装置中后，充体积分数为0.95的N20.05的CO2气体4 h，流速为0.2 L/min，以造成缺氧环境，于复氧48 h测定相关指标。

　　1.2.3 四唑蓝比色法测定神经元活力 96孔板之每孔中加入5 mg/mL四甲基偶氮唑蓝磷酸缓冲液10 μL，继续培养4 h后弃去上清液，再加入100 μL二甲基亚砜均匀振荡10 min，在酶标仪(测量波长600 nm)上读取数值为吸光度值，以吸光度值表示海马神经元的活力。

　　1.2.4 Annexin VFITC法检测神经元凋亡率 海马神经元按以下程序处理：0.1 mol/L PBS漂洗后，0.125%胰蛋白酶消化5 min，终止消化后制备单细胞悬液，收集细胞并离心(1 000 r/min)5 min，弃去胰蛋白酶后，0.1 mol/L PBS漂洗2次，以含Ca2+缓冲液将神经元浓度稀释为1×106 mL1，加Annexin V(1∶20)避光反应10 min，再以PI(1∶20)标记后，立即在流式细胞仪上测定凋亡率。

　　1.2.5 Western blot检测JNK蛋白的表达 采集细胞后，1 200 r/min离心5 min收集细胞，加入80 μL细胞裂解液，冰上裂解30 min后，4 ℃再离心(12 000 r/ min)5 min。上样前将样品煮沸5 min，计算含50 μg蛋白的溶液体积即为上样量。垂直电泳两玻璃板间隙中灌注12%分离胶及5%浓缩胶，加入Marker 10 μL，其余空格按预定顺序加样。电泳在浓缩胶电压80 V，分离胶电压100 V，总时间2.5 h左右;而后在4 ℃、电流200 mA条件下转膜45～60 min，将蛋白转移至NC膜，10%脱脂牛奶封闭NC膜2 h，将多克隆兔抗大鼠JNK抗体(1∶500)与NC膜充分接触杂交，4 ℃下过夜，后与βactin(1∶1 000)杂交反应3～5 h，再与山羊抗兔IgG抗体二抗(1∶2 000)于室温下孵育2 h，然后显影、定影、图象分析。结果用Gel Doc凝胶成像分析系统扫描目标条带的分子量，成像结果用Quantity One软件行半定量分析，以A组为对照，取相对值。

　　1.3 统计学处理 计量资料以x±s表示，采用SPSS 13.0统计软件包进行数据处理。单因素方差分析，Newmankeuls两两比较。P<0.05为差别有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 海马神经元的鉴定结果及活力、凋亡率比较 光镜下随机计数8个非重叠视野细胞，计算NSE阳性细胞百分率，海马神经元所占比例为(87.7±5.6)%，见图1。缺氧复氧后海马神经元活力下降，凋亡率增大(P<0.05);D组活力高于其他缺氧组，而凋亡率则低于其他缺氧组(P<0.05)。各组海马神经元吸光度值、凋亡率比较见表1。 细胞质和突起被染成棕褐色为海马神经元，其他未被深染色的细胞为非神经元.表1 各组海马神经元的吸光度、凋亡率和JNK蛋白表达比较

　　2.2 JNK蛋白的定量分析 缺氧复氧后，JNK蛋白表达增强。与B组比较，C和D组JNK表达均明显减弱(P<0.05)，JNK在C组减弱19%，D组减弱35%。B组与E组比较无统计学差异(P>0.05)。与C组比较，D组的JNK表达减弱(P<0.05)。各组JNK蛋白具体表达和比较见图2和表1。

　　3 讨 论

　　脑缺血/缺氧严重危害人类健康，积极探索缺血/缺氧导致脑损伤机制和有效防治措施，具有重要的临床价值。在脑内，MitoKATP含量极为丰富，DZ激活MitoKATP后能产生理想的保护效果。本研究中DZ预处理的剂量、时间、方法和5HD剂量是根据前期实验基础确定的[5]。应用四唑蓝比色法测定活细胞的吸光密度值代表细胞的活力，可以反映海马神经元的存活率。缺氧复氧损伤后，DZ 100 μmol/L组活力大于DZ 0 μmol/L组、凋亡率低于DZ 0 μmol/L组;而DZ+5HD组与DZ 0 μmol/L组的活力和凋亡率比较无统计学差异，以上说明DZ 100 μmol/L可通过开放MitoKATP通道诱导海马神经元产生缺氧耐受。已知的主要机制是，开放MitoKATP可降低线粒体膜电位，线粒体适度去极化，抑制细胞质钙离子向线粒体内流，减轻线粒体内钙超载[6];限制缺氧/缺血后线粒体的肿胀，使线粒体的体积保持在适当范围内以维持线粒体内电子传递和能量生成[7];MitoKATP的活化还可以减少细胞色素C的释放，诱导Bcl2表达增加，抑制Bax易位，抑制凋亡发生[5]。实验中，DZ 30 μmol/L组与DZ 0 μmol/L组的活力、凋亡率比较均未见统计学差异，这同时提示DZ发挥预处理效应与剂量有关。

　　JNK为54kD的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，含双磷酸化功能区ThrProTyr，可与cJun N端的活化区结合并使其第63、73位丝氨酸残基磷酸化，因而又被称为cJUN氨基末端激酶。目前认为，JNK可通过以下途径发挥促凋亡作用[810]：增强转录因子复合物AP1的活性从而促进多种凋亡蛋白表达;磷酸化并抑制线粒体膜上的Bcl2和Bclxl，线粒体膜上PT孔开放，释放cytc入细胞质;刺激下游底物Bim，将信号传到Bax，也可导致线粒体释放cytc。本实验中，与对照组比较，缺氧复氧后各组JNK蛋白表达程度明显增强的同时，凋亡率增大，存活率下降，提示JNK信号通路可能参与了缺氧复氧损伤所致的细胞凋亡损伤过程。与DZ 0 μmol/L组比较，DZ 100 μmol/L组JNK蛋白表达明显减弱，凋亡率下降，活力升高;而给予MitoKATP 通道的选择性抑制剂5HD后，以上变化被消除，提示DZ预处理可能通过抑制JNK活性表达，减轻凋亡发生。Jiang等在对新生大鼠海马和皮质缺血/缺氧的研究中，发现DZ预处理能抑制细胞核JNK的底物cJun蛋白的表达增加[11]。尽管DZ 30 μmol/L和DZ 100 μmol/L组的JNK蛋白表达有统计学差异，但此2组之间的凋亡率和活力比较无统计学差异，这可能是缺氧复氧后神经元的凋亡同时受多种信号转导调控，受其他因素的干扰，DZ 30 μmol/L未能有效减低凋亡率。

　　笔者认为，JNK信号在诱导海马神经元细胞凋亡过程中起重要作用，DZ可能抑制JNK的表达而减低缺氧复氧后大鼠海马神经元的凋亡。但DZ如何抑制JNK信号转导，JNK出现的高峰及与细胞凋亡的具体关联，尚需进一步研究。

参考文献

1] Rajapakse N，Shimizu K，Kis B，et al. Activation of mitochondrial ATPsensitive potassium channels prevents neuronal cell death after ischemia in neonatal rats[J]. Neurosci Lett， 2002，327(3):208212.

　　[2] Dirnagl U，Simon R P，Hallenbeck J M. Ischemic tolerance and endogenous neuroprotection[J]. Trends Neurosci， 2003，26(5):248254.

　　[3] Kuan C Y，Whitmarsh A J，Yang D D，et al. A critical role of neuralspecific JNK3 for ischemic apoptosis[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2003，100(25):1518415189.

　　[4] Shinozaki Y，Sato Y，Koizumi S，et al. Retinoic acids acting through retinoid receptors protect hippocampal neurons from oxygenglucose deprivationmediated cell death by inhibition of cjunNterminal kinase and p38 mitogenactivated protein kinase[J]. Neuroscience， 2007，147(1):153163.

　　[5] Liu R G，Wang W J，Song N，et al. Diazoxide preconditioning alleviates apoptosis of hippocampal neurons induced by anoxiareoxygenation in vitro through upregulation of Bcl2/Bax protein ratio[J]. Acta Physiologica Sinica， 2006，58(4):345350.

　　[6] Domoki F，Bari F，Nagy K，et al. Diazoxide prevents mitochondrial swelling and Ca2+ accumulation in CA1 pyramidal cells after cerebral ischemia in newborn pigs[J]. Brain Res， 2004，1019(12):97104.

　　[7] 蔡扬帆，林霓阳. 神经元线粒体ATP敏感性钾通道与脑保护的研究进展[J]. 国际内科学杂志，2007，34(6):362365.

　　[8] Chen R W，Qin Z H，Ren M，et al. Regulation of cJun Nterminal kinase， p38 kinase and AP1 DNA binding in cultured brain neurons: roles in glutamate excitotoxicity and lithium neuroprotection[J]. J Neurochem， 2003，84(3):566575.

　　[9] Tournier C，Hess P，Yang D D，et al. Requirement of JNK for stressinduced activation of the cytochrome cmediated death pathway[J]. Science， 2000，288(5467):870874.

　　[10] Okuno S，Saito A，Hayashi T，et al. The cJun Nterminal protein kinase signaling pathway mediates Bax activation and subsequent neuronal apoptosis through interaction with Bim after transient focal cerebral ischemia[J]. J Neurosci， 2004，24(36):78797887.

　　[11] Jiang K W，Yu Z S，Shui Q X，et al. Activation of ATPsensitive potassium channels prevents the cleavage of cytosolic mucalpain and abrogates the elevation of nuclear cFos and cJun expressions after hypoxicischemiain neonatal rat brain[J]. Brain Res Mol Brain Res， 2005，133(1):8794.