泛素蛋白酶体通路异常与阿尔茨海默病的发生

【关键词】 阿尔茨海默病； 泛素蛋白连接酶复合物； tau蛋白类，微管相关蛋白质类

　　蛋白质是构成细胞生命活动的重要物质之一，其在细胞内的生成和降解保持着一种平衡，一旦打破了这种平衡可使蛋白质的生物学功能发生改变。在真核细胞中主要有两种蛋白质降解途径：一种是溶酶体途径；另一种是非溶酶体途径，主要有泛素蛋白酶体通路(UbiquitinProteasome pathway，UPP)[1]。UPP是细胞内蛋白质降解的重要途径，能够识别多余的和错误折叠的蛋白质，使其分解成小分子的肽段，以保持细胞内蛋白质的平衡。UPP的异常可导致某些疾病的发生[2]。阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病，其主要病理特征为额颞叶和海马等部位出现选择性胆碱能神经元和突触缺失、老年斑（senile plaques，SP）和神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)[3]，其中SP和NFT是AD临床诊断以及区别于其他类型痴呆的主要特征。NFT由变性双股螺旋纤维（paired helical filament，PHF）所组成，PHF的主要成分是高度磷酸化的tau蛋白。SP的主要成分是β淀粉样蛋白（amyloid beta， Aβ）。异常过度磷酸化tau蛋白和Aβ是AD发病的重要机制。自1987年George等在死亡AD患者的大脑内NFT和SP中发现了泛素(ubiquitin，Ub)的存在以来[4]，UPP异常与AD发生发展之间的关系迅速成为研究热点。笔者就UPP中的关键酶泛素连接酶(E3s)对tau蛋白和Aβ两种蛋白的调控以及UPP中相关的异常情况与AD发生发展的关系等做一综述。

　　1 UPP组成及其作用过程
　　
　　Ub是由Goldstein首先发现的一种广泛存在于真核细胞内的高度保守的多肽。单个Ub分子由76个氨基酸组成，其分子量约为8.5 kD。Ub能够利用其末端76位的甘氨酸与目的靶蛋白的α或ε氨基共价结合，使目的蛋白能够带上泛素化标记，以便进一步降解。细胞内蛋白的泛素化作用参与了多种细胞生物学功能，例如细胞周期进程、细胞增生与分化、细胞凋亡等[5]。
　　
　　26 S蛋白酶体是一个分子量巨大（约为2 000 kD）的蛋白酶体复合物体，由20 S以及19 S两种结构组装而成。20 S呈桶状，由7个α亚基和7个β亚基所形成的七聚体环状结构，分为α7环和β7环。两个α7环构成桶顶部和底部，两个β7围成桶腰，是蛋白酶体的催化核心。19 S呈帽状结构，由18个亚基组成，具有ATP依赖和Ub识别功能，它在ATP和20 S核心存在下组装成有活性的26 S蛋白酶体[6]。
　　
　　UPP降解细胞内蛋白质的过程十分复杂且涉及一系列酶，包括泛素活化酶（Els）、泛素结合酶(E2s)、E3s。另外，该途径中还具有一种泛素解离酶能释放出结合的Ub，使得Ub能够循环使用。整个UPP降解细胞内蛋白质过程分成了两个连续的步骤[7]：（1）多聚泛素化链的形成。这个步骤分为三个级联反应：E1s利用ATP水解释放能量活化Ub；E1s将活化的Ub传递给E2s，形成UbE2s中间体；在E3s的催化下，Ub的C末端与靶蛋白的赖氨酸残基的一个酰胺异构肽键相连，形成了泛素化的蛋白质。泛素化蛋白分子上的48位赖氨酸残基进一步不断地泛素化，最终形成多聚泛素化蛋白质。（2）多聚泛素化的蛋白质通过蛋白酶体的识别，最终将底物蛋白水解成含有3～22个的多肽碎片。多聚泛素化链中的Ub分子则在DUBs的作用下分解成单个的Ub分子后重新利用，从而形成了一个完整的泛素蛋白酶体循环。

　　2 UPP中参与tau蛋白和Aβ降解的E3连接酶
　　
　　在UPP中E3连接酶是其选择性降解机制的关键因素，能够将Ub、底物蛋白还有26 S蛋白酶体连接起来，起到了桥梁的作用。UPP中E3连接酶的数量众多，有研究表明，其中多种E3连接酶如parkin，HRD1，CHIP等都能够参与调控AD中两个重要效应分子tau蛋白和Aβ的降解[811]。热休克蛋白70同源蛋白（HSC70）羧基端相互作用蛋白 (carboxyl terminus of HSC70interacting protein， CHIP)在AD中的研究最多，现以CHIP为例，介绍UPP对AD中的两种关键蛋白的作用。

　　2.1 CHIP蛋白的结构和功能

　　CHIP基因编码是一个由303个氨基酸组成的强细胞质蛋白，分子量约为35 kD。CHIP结构中含有两个重要功能区，即N末端的3个TPR结构域和C末端的1个高度保守的UBox结构域，两者由一段富含电荷结构域相连。TPR结构由34个氨基酸残基构成，构成脚手架样的结构，介导蛋白质间的相互作用。目前已发现很多蛋白含有TPR结构域。TPR蛋白家族的成员都可以和HSP70和HSP90等分子伴侣蛋白结合，参与分子伴侣蛋白状态调控[12]。2001年，Murata等发现在CHIP蛋白中含有具有E3活性的UBox结构域，可通过泛素蛋白酶体系统介导蛋白质的降解[13]。对于AD中的两个重要的效应分子磷酸化tau蛋白和Aβ来说，CHIP蛋白也是利用其E3的活性对这两种蛋白进行降解，维持了神经细胞的活性。

　　2.2 CHIP蛋白与tau蛋白和Aβ

　　tau蛋白是一种微管相关蛋白，它与管蛋白结合形成微管。在神经细胞中，微管结构的完整性是神经细胞胞体和轴突间营养物质运输的基础。tau蛋白保持着微管的稳定性，因此其活性的高低调控着神经细胞的活性。tau蛋白在细胞内主要受到了蛋白激酶（如GSK3β、PKC、MAPK等）和蛋白磷酸酶（如PP1、PP2A等）的调节，保持着相对的稳定和活性。但是在病理情况下，tau蛋白在多个位点上发生异常磷酸化，丧失了生物学活性，导致tau蛋白从微管上解离。同时，异常磷酸化的tau蛋白易于发生聚积，最终形成神经原纤维缠结。因此，异常过度磷酸化tau蛋白是AD 发病的重要效应分子。福建医科大学学报 2010年6月 第44卷第3期陈 斌等：泛素蛋白酶体通路异常与阿尔茨海默病的发生
　　
　　Shimura等利用免疫沉淀技术从脑中分离出tau蛋白，然后利用PP2A、PTP1B、Oglycosidase、Nglycosidase以及GSK3β将其磷酸化并在体外进行泛素化观察发现，只有PP2A去磷酸化的tau蛋白不能被Ub识别，提示磷酸化的tau蛋白是Ub识别其的主要标志[14]。该小组继续对泛素化过程中的各种酶进行了筛选后发现，执行着这一识别过程的是一种E2结合酶UbcH5B。CHIP上的Ubox结构能够与识别了磷酸化tau蛋白的UbcH5B结合，递送给CHIP蛋白中TPR结构域上的HSP70和HSP90，形成了一种tau/HSP/CHIP的聚合体。这种HSP/CHIP聚合体能够被Bcl2相关的永生基因1（Bcl2associated athanogene1，BAG1）迅速识别，将聚合体送进26 S蛋白酶体中进行降解[15]。在体内实验中也发现，CHIP蛋白和磷酸化tau蛋白有着密切的联系。Naruhiko等发现在AD患者的脑内以及在JNPL3小鼠脑中CHIP蛋白水平增高。同时，将小鼠的CHIP基因敲除发现不溶性的tau蛋白水平明显升高[16]。进一步说明了，CHIP蛋白与tau蛋白之间的密切联系。
　　
　　Aβ是由淀粉前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）受到了α分泌酶和β分泌酶的作用后产生的毒性代谢产物，是构成AD中SP的主要物质，被认为是发生AD的各种病理变化的始动因素之一。CHIP蛋白除了可以调节tau蛋白的降解，也可以对Aβ进行清除，降低Aβ的毒性[17]。这种调节也是通过形成HSP/CHIP聚合体的形式来完成的。此外，该复合体还能够结合APP，通过调节其代谢来减少Aβ的合成。有意思的，是Aβ的生成过多会反过来抑制蛋白酶体的活性，使得这种聚合体发生堆积，不利于清除Aβ[1819]。

　　3 UPP的异常与AD的发生发展的关系
　　
　　UPP是细胞内蛋白质平衡的主要调控手段，被认为是细胞内蛋白质的质量控制系统。在AD中，UPP自身出现了问题便会导致过度磷酸化tau蛋白和Aβ的降解发生障碍。
　　
　　泛素蛋白分子上的48位赖氨酸是其结合底物蛋白并不断连接Ub形成多聚泛素化的主要位点。Diane等利用LCMS/MS的方法在AD患者的大脑中发现，PHFtau同Ub结合的部位除了正常的lys48外，还包括了lys6和lys11。同时，该小组还发现lys6的连接方式会导致蛋白酶体的抑制，减少了磷酸化tau蛋白的降解[2021]。
　　
　　1998年，Van leeuwen等在AD患者脑中发现了一种变异的泛素蛋白（UBB+1）[22]。这种变异蛋白是由于泛素蛋白mRNA中一个核苷酸缺失造成了错读而产生的。虽然UBB+1不会阻断多聚泛素化聚合物的形成，但是UBB+1能够抑制26 S蛋白酶体的活性，使得多聚泛素化的产物堆积，促进了神经细胞的死亡。此外，Song等还发现了一种与Aβ相关联的特殊的E2结合酶E225K/Hip25K[23]。E225K/Hip25K虽然也能够催化泛素化结合过程，但是却不能形成多聚泛素化体，导致不能够进入26 S蛋白酶体进行降解。不仅如此，E225K/Hip25K还能调节Aβ对蛋白酶体抑制作用。减少了E225K/Hip25K的表达可以阻断Aβ对蛋白酶体的抑制作用；相反表达增多，增强了Aβ对蛋白酶体的抑制，促进了神经细胞的死亡。
　　
　　除了泛素蛋白会自身变异外，Alex等在细胞中还发现了一种新的蛋白叫类泛素样蛋白（ubiquilin）[24]。这种蛋白能够特异性结合早老素蛋白促进其聚集，增加了Aβ的合成，并且这类蛋白不能被蛋白酶体降解，导致Aβ的堆积。
　　
　　泛素蛋白酶体系统保持着细胞尤其是神经细胞内的蛋白质处于稳定状态，及时处理错误折叠的蛋白垃圾，成为了机体内的蛋白质控制系统。上述的资料也表明，错误折叠和修饰的tau蛋白以及有毒性的Aβ也都是通过UPP来降解的。笔者认为，无论是Ub自身的变异还是其他物质的干扰抑制使该通路一旦出现异常就会造成对tau蛋白和Aβ无法及时清除，导致堆积，产生NFT和SP。随着缠结和斑块的不断聚集又会抑制蛋白酶体的降解活性，由此恶性循环，不断促进AD的发生发展。因此，进一步搞清楚这个复杂系统不仅能够增进对AD的发病机制的认识，而且可为AD的治疗提供了新的思路和途径。

参考文献

　　[1] Micheal H G，Aaron C. The ubiquitinproteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction[J]. Physiol Rev， 2002，82(2):373428.

　　[2] 吴慧娟，张志刚. 泛素蛋白酶体途径及意义[J]. 国际病理科学与临床杂志， 2006，26(1):710.

　　[3] Dickson D W. Neuropathological diagnosis of Alzheimer’s disease: a perspective from longitudinal clinicopathological studies [J]. Neurobiol Aging， 1997，18 (4 Suppl):S2126.

　　[4] George P， Robert F， Gerry S， et al. Ubiquitin is detected in neurofibrillary tangles and senile plaque neurites of Alzheimer disease brains [J]. PNAS，1987，84：30333036.

　　[5] 刘萱，曹诚，刘传暄. 泛素蛋白酶体降解途径在细胞周期调控中的作用[J]. 生物技术通讯， 2004，15(3):267270.

　　[6] Avram H， Aaron C， Alexander V. The ubiquitin system [J]. Nat Med， 2000， 6:10731081.

　　[7] 郭卉，张雪竹. 泛素蛋白酶体途径及其生物学作用的研究进展[J]. 现代生物医学进展， 2008，8(9):17861788.

　　[8] Dmitry G，Ronald K H. CHIPping away at tau[J]. J Clin Invest， 2007，117(3):590592.

　　[9] Kenneth S K， Hideki S. Phosphorylated tau and the neurodegenerative foldopathies[J]. (BBA)  Molecular Basis of Dis， 2005， 1739:298310.

　　[10] Burns M P， Zhang L，Rebeck G W， et al. Parkin promotes intracellular Aβ1–42 clearance [J]. Human Molecular Genetics， 2009 18(17):32063216.

　　[11] Masayuki K， Hiroshi K， Ryo S， et al. Loss of HRD1cediated protein degradation causes amyloid precursor protein accumulation and amyloidβ generation[J]. J Neurosci， 2010， 30(11):39243932.

　　[12] Shigeo M， Tomoki C， Keiji T. CHIP: a qualitycontrol E3 ligase collaborating with molecular chaperones[J]. Int J Biochem Cell Biol， 2003，35:572578.

　　[13] Holly M， Cam P. CHIP: a link between the chaperone and proteasome systems[J]. Cell Stress Chaperones， 2003，8 (4):303308.

　　[14] Hideki S， Daniel S， Steeven P， et al. CHIPHsc70 complex ubiquitinates phosphorylated tau and enhanced cell survival[J]. J Biol Chem， 2004， 279(6):48694876.

　　[15] Demand J， Alberti S， Patterson C， et al. Cooperation of a ubiquitin domain protein and an E3 ubiquitin ligase during chaperone/proteasome coupling[J]. Curr Boil， 2001， 11(20):15691577.

　　[16] Naruhiko S， Miyuki M， Tatsuya M， et al. In vivo evidence of CHIP upregulation attenuating tau aggregation [J]. J Neruochem， 2005， 94:12541263.

　　[17] Pravir K， Rashmi K A， Vimal V， et al. CHIP and HSPs interact with βAPP in a proteasomedependent manner and influence Aβ metabolism [J]. Hum Mol Genet， 2007， 16(7):848864.

　　[18] Lusia G， Chana F， Maria E F， et al. Amyloid βprotein inhibits ubiquitindependent protein degradation in vitro[J]. J Biol Chem， 1995， 2709(34):1970219708.

　　[19] Tseng B P，Green K N，Chan J L，et al. Aβ inhibits the proteasome and enhances amyloid and tau accumulation[J]. Neurobiol Aging， 2008， 29(11):16071618.

　　[20] Yael D，Tamar Z，Arie A， et al. The E2 ubiquitinconjugating enzymes Direct polyubiquitination to preferred lysines[J]. J Biol Chem， 2010， 285:85958604.

　　[21] Diane C，Stefani N T，Young J，et al. Alzheimer diseasespecific conformation of hyperphosphorylated paired helical filamentTau is polyubiquitinated through Lys48， Lys11， and Lys6 ubiquitin conjugation [J]. J Biol Chem， 2006， 281(16):1082510838.

　　[22] Van Leeuwen F W，de Kleijn D P，van den Hurk H H，et al. Frame shift mutants of β amyloid precursor protein and ubiquitinB in Alzheimer’s and Down patients [J]. Science， 1998，279：242247.

　　[23] Song S M，Kim S Y，Hong Y M，et al. Essential role of E2–25K/Hip2 in mediating amyloidb neurotoxicity [J]. Mol Cell， 2003， 12:553563.

　　[24] Alex L M， Geroge P， Mark A S， et al. Identification of ubiquilin， a novel presenilin interactor that increases presenilin protein accumulation[J]. J Cell Biol， 2000，151：847862.

　　除了泛素蛋白会自身变异外，Alex等在细胞中还发现了一种新的蛋白叫类泛素样蛋白（ubiquilin）[24]。这种蛋白能够特异性结合早老素蛋白促进其聚集，增加了Aβ的合成，并且这类蛋白不能被蛋白酶体降解，导致Aβ的堆积。
　　
　　泛素蛋白酶体系统保持着细胞尤其是神经细胞内的蛋白质处于稳定状态，及时处理错误折叠的蛋白垃圾，成为了机体内的蛋白质控制系统。上述的资料也表明，错误折叠和修饰的tau蛋白以及有毒性的Aβ也都是通过UPP来降解的。笔者认为，无论是Ub自身的变异还是其他物质的干扰抑制使该通路一旦出现异常就会造成对tau蛋白和Aβ无法及时清除，导致堆积，产生NFT和SP。随着缠结和斑块的不断聚集又会抑制蛋白酶体的降解活性，由此恶性循环，不断促进AD的发生发展。因此，进一步搞清楚这个复杂系统不仅能够增进对AD的发病机制的认识，而且可为AD的治疗提供了新的思路和途径。

参考文献

　　[1] Micheal H G，Aaron C. The ubiquitinproteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction[J]. Physiol Rev， 2002，82(2):373428.

　　[2] 吴慧娟，张志刚. 泛素蛋白酶体途径及意义[J]. 国际病理科学与临床杂志， 2006，26(1):710.

　　[3] Dickson D W. Neuropathological diagnosis of Alzheimer’s disease: a perspective from longitudinal clinicopathological studies [J]. Neurobiol Aging， 1997，18 (4 Suppl):S2126.

　　[4] George P， Robert F， Gerry S， et al. Ubiquitin is detected in neurofibrillary tangles and senile plaque neurites of Alzheimer disease brains [J]. PNAS，1987，84：30333036.

　　[5] 刘萱，曹诚，刘传暄. 泛素蛋白酶体降解途径在细胞周期调控中的作用[J]. 生物技术通讯， 2004，15(3):267270.

　　[6] Avram H， Aaron C， Alexander V. The ubiquitin system [J]. Nat Med， 2000， 6:10731081.

　　[7] 郭卉，张雪竹. 泛素蛋白酶体途径及其生物学作用的研究进展[J]. 现代生物医学进展， 2008，8(9):17861788.

　　[8] Dmitry G，Ronald K H. CHIPping away at tau[J]. J Clin Invest， 2007，117(3):590592.

　　[9] Kenneth S K， Hideki S. Phosphorylated tau and the neurodegenerative foldopathies[J]. (BBA)  Molecular Basis of Dis， 2005， 1739:298310.

　　[10] Burns M P， Zhang L，Rebeck G W， et al. Parkin promotes intracellular Aβ1–42 clearance [J]. Human Molecular Genetics， 2009 18(17):32063216.

　　[11] Masayuki K， Hiroshi K， Ryo S， et al. Loss of HRD1cediated protein degradation causes amyloid precursor protein accumulation and amyloidβ generation[J]. J Neurosci， 2010， 30(11):39243932.

　　[12] Shigeo M， Tomoki C， Keiji T. CHIP: a qualitycontrol E3 ligase collaborating with molecular chaperones[J]. Int J Biochem Cell Biol， 2003，35:572578.

　　[13] Holly M， Cam P. CHIP: a link between the chaperone and proteasome systems[J]. Cell Stress Chaperones， 2003，8 (4):303308.

　　[14] Hideki S， Daniel S， Steeven P， et al. CHIPHsc70 complex ubiquitinates phosphorylated tau and enhanced cell survival[J]. J Biol Chem， 2004， 279(6):48694876.

　　[15] Demand J， Alberti S， Patterson C， et al. Cooperation of a ubiquitin domain protein and an E3 ubiquitin ligase during chaperone/proteasome coupling[J]. Curr Boil， 2001， 11(20):15691577.

　　[16] Naruhiko S， Miyuki M， Tatsuya M， et al. In vivo evidence of CHIP upregulation attenuating tau aggregation [J]. J Neruochem， 2005， 94:12541263.

　　[17] Pravir K， Rashmi K A， Vimal V， et al. CHIP and HSPs interact with βAPP in a proteasomedependent manner and influence Aβ metabolism [J]. Hum Mol Genet， 2007， 16(7):848864.

　　[18] Lusia G， Chana F， Maria E F， et al. Amyloid βprotein inhibits ubiquitindependent protein degradation in vitro[J]. J Biol Chem， 1995， 2709(34):1970219708.

　　[19] Tseng B P，Green K N，Chan J L，et al. Aβ inhibits the proteasome and enhances amyloid and tau accumulation[J]. Neurobiol Aging， 2008， 29(11):16071618.

　　[20] Yael D，Tamar Z，Arie A， et al. The E2 ubiquitinconjugating enzymes Direct polyubiquitination to preferred lysines[J]. J Biol Chem， 2010， 285:85958604.

　　[21] Diane C，Stefani N T，Young J，et al. Alzheimer diseasespecific conformation of hyperphosphorylated paired helical filamentTau is polyubiquitinated through Lys48， Lys11， and Lys6 ubiquitin conjugation [J]. J Biol Chem， 2006， 281(16):1082510838.

　　[22] Van Leeuwen F W，de Kleijn D P，van den Hurk H H，et al. Frame shift mutants of β amyloid precursor protein and ubiquitinB in Alzheimer’s and Down patients [J]. Science， 1998，279：242247.

　　[23] Song S M，Kim S Y，Hong Y M，et al. Essential role of E2–25K/Hip2 in mediating amyloidb neurotoxicity [J]. Mol Cell， 2003， 12:553563.

　　[24] Alex L M， Geroge P， Mark A S， et al. Identification of ubiquilin， a novel presenilin interactor that increases presenilin protein accumulation[J]. J Cell Biol， 2000，151：847862.