【摘要】 目的 研究松果体和褪黑素对大鼠下丘脑室旁核促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）神经元形态和功能的影响以及补充褪黑素的作用。 方法 雄性清洁级SD大鼠100只，随机分为对照组、假手术对照组、松果体摘除组、松果体摘除+褪黑素腹腔注射7.5 mg/kg组和松果体摘除+褪黑素腹腔注射15 mg/kg组，采用原位杂交和免疫组织化学方法来检测松果体摘除及补充褪黑素后下丘脑CRH神经元的变化。 结果 松果体摘除后大鼠下丘脑室旁核CRH表达增强。松果体摘除大鼠补充褪黑素后，CRH神经元表达增强呈剂量依赖性恢复，但不能恢复至正常。 结论 松果体摘除导致大鼠下丘脑室旁核CRH神经元合成CRH增加，补充外源性褪黑素后能在一定程度上逆转上述异常。松果体可能是神经内分泌免疫网络的结构和功能的重要稳定因素之一。
【关键词】 松果腺； 褪黑激素； 下丘脑室旁核； 神经元； 原位杂交； 免疫组织化学
近年来不少研究发现松果体褪黑素对下丘脑垂体肾上腺轴（hypothalamicpituitaryadrenal，HPA）有明显的调节作用[16]，而该轴分泌的糖皮质激素对机体的免疫功能具有明显的抑制作用，因此很多学者认为松果体褪黑素通过调节HPA轴进而调节免疫功能是其实现免疫调节的一个重要途径。松果体对垂体和肾上腺影响的研究已较为深入，体内、外实验无论从形态和功能方面都证明松果体褪黑素对HPA有调节作用[38]，但迄今为止松果体对下丘脑影响的研究主要停留在松果体褪黑素对下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)神经元分泌的CRH的影响的水平上。笔者研究是为进一步揭示松果体及褪黑素对免疫功能以及免疫相关性疾病如肿瘤、自身免疫性疾病等的影响机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 分组 选用2月龄雄性清洁级SD大鼠100只（浙江省实验动物中心，合格证书号：2001001），体质量(200±10）g。标准颗粒饲料，自由摄食饮水，自然光照。随机分为对照组（N组）、假手术对照组（Sham组）、松果体摘除组（M0组）、松果体摘除+褪黑素腹腔注射7.5 mg/kg组（M1组）和松果体摘除+褪黑素腹腔注射15 mg/kg组（M2组），注射时间为每天17∶00，注射后4，8周取材，M0组动物腹腔注射等量生理盐水。
1.1.2 主要试剂及仪器 褪黑素（美国Sigma公司），羊抗CRH多克隆抗体、羊ABC染色系统（美国Santa Cruz Biotechnology公司），大鼠CRH原位杂交试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），大鼠血清CRH ELISA试剂盒（美国ADR公司）。牙科涡轮高速牙床（cs181，上海齿科医械厂），手摇切片机（1712，德国Leica公司），光学显微镜（Bh3，日本Olympus公司），酶标检测仪（550，美国BioRad公司），数字显微摄像系统（日本Nikon公司），图像分析系统（JD801，南京捷达公司）。
1.2 方法
1.2.1 动物模型建立及取材选片 根据文献[9]，2%戊巴比妥钠麻醉（45 mg/kg）后，用牙科涡轮高速牙床，以人字缝为中心五边型磨开颅顶诸骨后摘除松果体。Sham组动物除不摘除松果体外，其余步骤同M0组。于术后4周和8周取全脑，10%甲醛固定，常规石蜡包埋，取材器械及配溶液所用的双蒸水均用DEPC处理，由于CRH神经元主要分布在下丘脑室旁核（paraventricular nucleus，PVN）后部的小细胞群[10]，故自前连合至乳头体前缘（下丘脑所在范围）行冠状面连续切片，片厚10 μm，每隔10片取1片按前后顺序用APES粘片并做苏木素伊红（HE）染色，镜下观察选出所有室旁核后部平面的切片。
1.2.2 下丘脑CRH原位杂交 随机选取每只动物室旁核后部3张切片行原位杂交检测CRH mRNA，杂交过程参见试剂盒说明。主要步骤为：3%h3O2 10 min，3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶10 min，PBS洗后入预杂交液40 ℃ 3 h，入杂交液（含CRH寡核苷酸探针）40 ℃过夜，SSC洗涤后加封闭液37 ℃ 30 min，入生物素化鼠抗地高辛37 ℃ 1 h，PBS洗后入SABC 37 ℃ 20 min，PBS洗后加生物素化过氧化物酶37 ℃ 20 min，PBS洗后DAB显色5 min，常规脱水透明封固。以预杂交液代替杂交液作为阴性对照。
1.2.3 下丘脑CRH免疫组织化学染色 随机选取每只动物室旁核后部3张切片行ABC法检测CRH，染色过程参见试剂盒说明。主要步骤为：微波修复15 min（修复液为柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0），PBS水洗后入3%h3O2 10 min，入一抗（工作浓度1∶200）4 ℃冰箱过夜，PBS洗后入生物素化二抗（工作浓度1∶100）1 h，PBS洗后入ABC复合物（工作浓度1∶50）30 min，PBS洗后DAB显色5 min，常规脱水透明封固。以PBS代替一抗作阴性对照。
1.2.4 显微摄像及图像处理分析 将免疫组织化学和原位杂交所获得的切片运用数字显微摄像系统进行拍照并运用图像分析软件进行定量检测。
1.2.5 判断标准 免疫组织化学和原位杂交染色均以细胞质中出现明显黄色或黄褐色颗粒为阳性表达，每只大鼠共测定3张室旁核后部切片的阳性细胞数、阳性面积和灰度，取均值。
1.3 统计学处理 数据以x±s表示，采用SPSS 12.0统计软件。数据行方差分析，组间两两比较用LSD检验进行显著性分析。P<0.05为差别有统计学意义。
2 结果
2.1 松果体摘除及应用外源性褪黑素后下丘脑室旁核CRH神经元转录水平的变化 各组的CRH阳性细胞主要分布于室旁核后部背内侧小细胞亚核，即后大细胞亚核与第三脑室之间的区域。M0组的外侧小细胞亚核和腹内侧小细胞亚核也出现了不少阳性细胞。CRH阳性细胞形态多样，以梭形为主，发出若干突起，免疫反应物均匀分布于胞质中。M0组与N组和Sham组相比，CRH阳性细胞数增加，阳性面积增加，平均灰度降低（P<0.05），补充褪黑素后呈剂量依赖性恢复，M2组与M0组相比差别有统计学意义（P<0.05），阳性细胞主要局限于背内侧小细胞亚核和腹内侧小细胞亚核，但无论是M2还是M1组上述指标与Sham组相比差别有统计学意义。N组与Sham组比较差别无统计学意义，术后4周与术后8周的结果差别无统计学意义（图1，表1）。
2.2 松果体摘除及应用外源性褪黑素后下丘脑室旁核CRH神经元蛋白合成水平的变化 下丘脑室旁核CRH免疫组织化学结果提示，CRH阳性细胞的分布、形态与原位杂交的结果相似，免疫反应产物亦位于胞质，各种指标的分析结果与原位杂交相仿（图2，表2）。
表1 松果体摘除及应用褪黑素后下丘脑CRH原位杂交结果分析（略）
Tab 1 The output of hypothalamic CRH ISH after pinealectomy and melatonin treatment
n=10. CRH：促肾上腺皮质激素释放激素；ISH：原位杂交. N：对照组；Sham：假手术对照组；M0：松果体摘除组；M1：松果体摘除+褪黑素腹腔注射7.5 mg/kg组；M2：松果体摘除+褪黑素腹腔注射15 mg/kg组. 组内与Sham组比较， ☆：P<0.05；组内与M0组比较，#：P<0.05.
表2 松果体摘除及应用褪黑素后下丘脑CRH免疫组化染色结果（略）
Tab 2 The output of hypothalamic CRH IHC after pinealectomy and melatonin treatment
n=10. CRH：促肾上腺皮质激素释放激素；IHC：免疫组织组织化学. N：对照组；Sham：假手术对照组；M0：松果体摘除组；M1：松果体摘除+褪黑素腹腔注射7.5 mg/kg组；M2：松果体摘除+褪黑素腹腔注射15 mg/kg组. 组内与Sham组比较，☆：P<0.05；组内与M0组比较，#：P<0.05. CRH：促肾上腺皮质激素释放激素；mpd：背内侧小细胞亚核；DAB：diaminobezidin；ISH：原位杂交. A：假手术对照组室旁核CRH 阳性细胞较少；B：松果体摘除组阳性细胞明显增多；C：褪黑素低剂量组阳性细胞相对B稍有减少；D：褪黑素高剂量组阳性细胞相对B减少明显；E：假手术对照组mpd高倍观；F：松果体摘除组mpd高倍观. A～D：DAB显色，3.3×10；E～F：DAB显色，苏木素复染，3.3×40.
图1 松果体摘除及应用褪黑素4周后下丘脑CRH原位杂交表达（略）
Fig 1 ISH of CRH in hypothalamus 4 weeks after pinealectomy and melatonin treatment
CRH：促肾上腺皮质激素释放激素；mpd：背内侧小细胞亚核；DAB：diaminobezidin；ISH：原位杂交. A：假手术对照组室旁核CRH 阳性细胞较少；B：松果体摘除组阳性细胞明显增多；C：褪黑素低剂量组阳性细胞相对B稍有减少；D：褪黑素高剂量组阳性细胞相对B减少明显；E：假手术对照组mpd高倍观；F：松果体摘除组mpd高倍观. A～D：DAB显色，3.3×10；E～F：DAB显色，苏木素复染，3.3×40.
图2 松果体摘除及应用褪黑素4周后下丘脑室旁核CRH免疫组化染色结果（略）
Fig 2 Immunohistochemical demonstration of hypothalamic CRH 4 weeks after pinealectomy and melatonin treatment
3 讨论
松果体作为一个神经内分泌器官。自1980年代初Maestroni等首次发现褪黑素对免疫系统的作用以来，褪黑素对神经内分泌免疫网络影响的研究迅速展开[11]。研究发现，松果体褪黑素能在不同层次直接或间接地影响HPA轴的功能，而HPA轴受刺激后最终分泌的糖皮质激素对机体的免疫功能和糖代谢等有明显的调节作用，因此松果体褪黑素可经由HPA轴来调节机体的免疫反应或影响其它生理功能[15]。HPA轴包括下丘脑、垂体、肾上腺三个水平，前者主要由CRH神经元构成，位于该轴最高点，且涉及下丘脑室周部的重要核团——室旁核，结构较为复杂，影响因素较多，前人的研究成果有些并不一致，因此颇具研究价值[12，12]。
本实验结果显示，开颅和结扎矢状窦而不摘除松果体的手术刺激在术后4周后对CRH神经元的功能没有明显影响。松果体摘除后大鼠下丘脑室旁核CRH原位杂交和免疫组织化学的结果与Sham组相比均显示阳性细胞数增多、阳性面积增加、平均灰度降低，提示松果体摘除后室旁核CRH神经元的表达增强，CRH基因的转录和翻译均增加。本实验发现，原位杂交与免疫组织化学的结果相一致，这一点与其它学者在正常机体中枢神经系统CRH定位的研究发现一致[10]。
为探求松果体摘除后室旁核CRH原位杂交和免疫组织化学结果的变化是否由其分泌产物褪黑素分泌的锐减引起，笔者对摘除松果体的大鼠补充褪黑素，发现下丘脑原位杂交和免疫组织化学CRH染色增强呈剂量依赖性恢复，但褪黑素应用的两个不同时段和两种不同剂量均不能使CRH恢复至正常状态，具体机制有待进一步研究。
为明确松果体及其褪黑素对下丘脑CRH神经元的影响是否与时间因素相关，本实验分别采用术后4周和术后8周两个不同时期进行取材，发现二者之间无显著性差别，说明松果体摘除以及补充褪黑素对下丘脑CRH神经元的影响并未随时间延长而发生改变，体内也未见明显的代偿过程，证明术后4周是观察实验结果的一个较好时段。因为大鼠松果体摘除后约2周创口才完全愈合，手术作为一种创伤会引进大鼠应激反应，激活HPA轴，导致室旁核内大量释放CRH，从而影响实验结果。
综上所述，松果体摘除导致大鼠下丘脑室旁核CRH神经元合成CRH增加，而补充外源性褪黑素后能在一定程度上逆转上述异常，提示松果体及其褪黑素可能是神经内分泌免疫网络的结构和功能的稳定因素之一。
参考文献
[1] Konakchieva R，Mitev Y， Almeida O F， et al. Chronic melatonin treatment and the hypothalamopituitaryadrenal axis in the rat: attenuation of the secretory response to stress and effects on hypothalamic neuropeptide content and release[J]. Biol Cell， 1997，89（9）:587596．
[2] Konakchieva R，Mitev Y，Almeida O F，et al. Chronic melatonin treatment counteracts glucocorticoidinduced dysregulation of the hypothalamicpituitary adrenal axis in the rat[J]. Neuroendocrinology，1998，67（3）：171180．
[3] 沈玉先，魏 伟，陈孝龄，等. 松果体切除及褪黑素对垂体肾上腺轴的影响[J]. 中国药理学通报，1996，12（1）：6265．
[4] 钟历勇，沈自尹，冉瑞琼，等. 褪黑素对大鼠下丘脑垂体肾上腺轴及免疫功能受抑状态的影响[J]. 中国免疫学杂志，2003，19（11）：761764．
[5] Yamada K. Effects of melatonin on adrenal function in male rats[J].Res Commun Chem Pathol Pharmacol，1990，69（2）：241244．
[6] Stakov B. Effect of melatonin on glucocorticoidinduced immunity suppression studied in vitro[J]. Eksp Klin Farmakol， 2005，68（1）：4547．
[7] 王 莹，扬祖铭，朱海娟，等. 外源性褪黑素对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠血浆促肾上腺皮质激素和皮质酮的影响[J]. 实用儿科临床杂志，2008，23（6）：430432．
[8] Nussdorfer G G，Malendowicz，Andreis P G， et al. lk.Effect of melatonin on the secretary activity of isolated rat zona glomerulose cells[J]. Adv Pineal Res，1990，4（1）：169174．
[9] 周瑞祥，陈奕权． 大鼠松果体摘除模型的建立[J]．福建医学院学报，1992，26（2）：179180．
[10] 谢启文．现代神经内分泌学[M]．上海：上海医科大学出版社，1999：3739．
[11] Maestroni G J，Pierpaoli W． Pharmacologic control of the hormonally mediated immune response[M]. Psychoneuroimmunologyh. New York Academic Press，1981：405413．
[12] Perras B，Ozcan S，Fehm H L， et al. Melatonin does not inhibit hypothalamicpituitaryadrenal activity in waking young men[J]. J Neuroendocrinol，2005，17（12）：811816．