破骨细胞在中耳胆脂瘤骨质破坏中的作用

　　　　　　 作者：叶胜难， 马艳利， 易自翔

【摘要】 　　目的 探讨破骨细胞（OC）在胆脂瘤骨质破坏中所起的作用。 方法 通过免疫组织化学技术和计算机图像定量分析法，检测破骨细胞分化因子（RANKL）和骨保护素（OPG）在27例胆脂瘤和11例外耳道皮肤中的表达。光镜观察8例胆脂瘤周围破坏听小骨和2例正常听小骨的形态学；透射电镜观察5例胆脂瘤周围破坏听小骨和2例正常听小骨的超微结构。 结果 RANKL的阳性表达量在胆脂瘤中为（0.247 0±0.210 1），在外耳道皮肤为（0.045 2±0.078 9）（P<0.05）；RANKL/OPG比值在胆脂瘤中为(1.379 0±1.138 0)，在外耳道皮肤为(0.358 1±0.376 8)（P<0.05）；OPG在胆脂瘤中的阳性表达量为(0.202 6±0.094 9)， 在外耳道皮肤中的阳性表达量为(0.262 7±0.172 4)（P>0.05）。胆脂瘤周围破坏听小骨中有活性OC存在以及其参与骨破坏作用的证据。 结论 OC在胆脂瘤的骨质破坏中发挥一定的作用。

【关键词】 胆脂瘤，中耳； 破骨细胞； 破骨细胞分化因子； 骨保护素

　　胆脂瘤是一种由复层鳞状上皮包绕脱落上皮或角化物的囊性结构，囊外包被一层厚薄不一的纤维组织，与邻近的骨壁紧密相连，随着胆脂瘤的不断增大，压迫、破坏周围骨质，引起严重的颅内外并发症，重者危及生命。因此了解胆脂瘤骨质破坏的发生机制对于阻断疾病的发展及减少并发症的发生至关重要。关于胆脂瘤的骨破坏机制一直没有定论，国内外学者提出破骨细胞（osteoclast，OC）可能是胆脂瘤骨质破坏的最终作用细胞[1]。本研究通过免疫组织化学技术和形态学观察，从直接和间接两方面探讨OC在胆脂瘤骨质破坏中的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 胆脂瘤标本选自1998年1月-2005年12月手术治疗的27例患者，男性16例，女性11例，年龄（34.80±11.02）岁（15～67岁），均为第一次手术，诊断经病理证实。取其中11例患者的外耳道深处正常皮肤作对照。取其中8例患者的破坏听小骨做光镜观察，5例患者的破坏听小骨做电镜观察，2例尸体解剖的正常听小骨作对照。

　　1.2 方法

　　1.2.1 免疫组织化学染色 将新鲜标本按标准石蜡包埋技术流程制成蜡块，作厚度4 μm连续切片，备用。免疫组织化学染色采用SP法，一抗分别为鼠抗人破骨细胞分化因子（receptor activator nuclear factor kappa B ligand，RANKL）抗体和鼠抗人骨保护素（osteoprotegerin，OPG）抗体（均购自美国Zymed公司）。主要操作步骤：石蜡切片脱蜡水化，3%过氧化氢室温孵育20 min，抗原修复（高压修复2 min），5%正常山羊血清封闭20 min，滴加一抗（工作浓度分别为RANKL 1∶50、OPG 1∶50），室温下孵育3 h，滴加生物素标记的二抗，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，显色剂底物DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。

　　1.2.2 计算机图像分析 采用高清晰度病理图像分析系统(ImagePro Plus 5.0，美国Media Cybernetics公司)，对27例胆脂瘤标本切片和11例外耳道正常皮肤组织标本切片的免疫组织化学染色结果进行定量分析，每张切片均选取不相重叠的5个代表部位，在400倍视野下测量阳性细胞的平均光密度，取其均值为该标本测量结果。

　　1.2.3 光镜观察 标本经10%甲醛固定24～48 h，用乙二胺四乙酸脱钙3～4周，以触之富有弹性、针能轻松刺入为准，常规石蜡包埋，连续切片制成5 μm厚的玻片，常规HE染色后光镜（BX51，日本Olympus公司）下观察。

　　1.2.4 电镜观察 标本修成1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm，用2.5%戊二醛固定，4 ℃保存，0.1 mol/L二甲砷酸钠溶液洗涤，1%四氧化锇后固定，酒精逐级脱水，环氧树脂包埋，制成超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，透射电镜（日立Hu12A型，日本）下观察。

　　1.3 统计学处理 阳性细胞染色结果以图像分析的光密度值（D，x±s）表示。采用SPSS 13.0软件包进行t检验，P<0.05为差别有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 免疫组织化学检测

　　2.1.1 RANKL的阳性表达 RANKL基因蛋白反应物呈棕黄色颗粒，阳性染色主要定位于细胞质和部分细胞膜。在27例胆脂瘤中，有22例可见RANKL的阳性表达，阳性染色细胞主要为胆脂瘤上皮层下的成纤维细胞和淋巴细胞，异物巨细胞和化生的腺体内皮细胞亦可见RANKL的阳性表达。在11例外耳道皮肤中，6例可见角质层细胞和少数棘层细胞呈RANKL弱阳性表达（图1）。分析显示，RANKL在胆脂瘤中的表达量明显高于外耳道皮肤（P<0.05，表1），二者差别具有统计学意义。

　　A:胆脂瘤上皮层下成纤维细胞和淋巴细胞（×200）；B:外耳道皮肤角质层细胞中弱阳性表达（×400）.

　　图1 破骨细胞分化因子在胆脂瘤及外耳道皮肤中的阳性表达（SP法）（略）

　　Fig 1 Expression of RANKL in cholesteatoma and ear canal skin (SP staining)

　　2.1.2 OPG的阳性表达 OPG的基因蛋白反应物呈棕黄色颗粒，阳性染色定位于细胞质，细胞核不着色。27例胆脂瘤中，25例可见OPG的大量表达，OPG的阳性染色细胞主要为胆脂瘤上皮细胞和上皮层下炎性肉芽组织中的炎性细胞，如淋巴细胞、成纤维细胞、异物巨细胞。11例外耳道皮肤中，9例可见OPG阳性表达，阳性细胞为整个上皮层和上皮层下的少量成纤维细胞、血管内皮细胞（图2）。分析显示，OPG在胆脂瘤和外耳道皮肤中的表达量差别无统计学意义（P>0.05，表1）。

　　2.1.3 RANKL/OPG的比较 分析显示，RANKL/OPG在胆脂瘤中的表达明显高于外耳道皮肤（P<0.05，表1）。

　　2.2 光镜观察 在8例胆脂瘤周围破坏听小骨的标本中，5例局部可见深蓝色、波纹状的骨质粘合线；2例观察到1～3个多核的活性破骨细胞，局部形成吸收陷窝（图3）。在2例正常听小骨标本中，均未发现活性破骨细胞的存在和破骨细胞参与作用的证据。

　　2.3 电镜观察 在5例胆脂瘤周围破坏听小骨标本中，2例观察到2个破骨细胞前体细胞，紧贴于破坏骨表面；1例观察到1个活性破骨细胞，见2个细胞核，细胞内富含溶酶体，与破坏骨交界处可见清晰的皱褶缘和透明区（图4）。在2例正常听小骨标本中，均未发现破骨细胞前体细胞或活性破骨细胞的存在。

　　A:胆脂瘤上皮层和成纤维细胞、淋巴细胞；B:外耳道皮肤中成纤维细胞、血管内皮细胞.

　　图2 骨保护素在胆脂瘤和外耳道皮肤中的阳性表达（SP法×400）（略）

　　Fig 2 Expression of OPG in cholesteatoma and ear canal skin (SP staining)

　　破骨细胞（蓝箭头），篮染的波纹状骨质粘合线（红箭头）和新生骨（黄箭头）.

　　图3 胆脂瘤周围破坏听小骨（HE×400）（略）

　　Fig 3 The osteoclast in damaged ossicular around cholesteatoma (HE staining)

　　贴附于骨表面的破骨细胞，透明带（蓝箭头示）和皱褶缘（红箭头示）.

　　图4 胆脂瘤周围破坏听小骨中的破骨细胞（×3 000）（略）

　　Fig 4 The osteoclast in damaged ossicular around cholesteatoma (×3 000)

　　表 1 OPG 和RANKL 在胆脂瘤和外耳道皮肤中的阳性表达（略）

　　Tab 1 The expression of OPG and RANKL in cholesteatoma and ear canal skin

　　OPG：骨保护素；RANKL：破骨细胞分化因子. 与胆脂瘤比较，☆：P<0.05.

　　3 讨论
　　
　　中耳胆脂瘤的骨质破坏机制迄今众说纷纭，一种观点认为OC是胆脂瘤骨质破坏的最终作用细胞[1]。Lacey等通过电镜，从胆脂瘤的破坏骨片中观察到含有皱褶缘的多核成熟OC贴附于骨吸收区表面，形成吸收小室，参与骨质破坏[2]。多种因素通过调节破骨细胞发挥作用。最新研究发现，RANKL是OC活化的最终环节，表达于成骨细胞的RANKL与表达于OC的特异性受体RANK结合，在巨噬细胞集落刺激因子存在的条件下，对OC的分化、活化、生存和附着在骨表面发挥骨吸收功能进行调控作用[36]。RANKL此种诱导OC活化发挥骨破坏作用的途径可完全被RANKL的诱饵受体OPG抑制[7]，其通过抑制OC前体细胞的分化、存活和融合，降低成熟OC的活性以及诱导OC的凋亡来抑制OC参与的骨破坏作用。骨组织微环境中，RANKL和OPG的相对水平（即RANKL/OPG比值）直接决定OC是被活化还是被抑制，高RANKL/OPG比值能发动和支持OC分化，是决定OC发生的主要分子信号机制。本研究结果显示，与OC活化密切相关的RANKL和RANKL/OPG在胆脂瘤中的表达较外耳道皮肤中增高（P<0.05），而抑制OC活化的OPG在胆脂瘤中的表达和外耳道皮肤中无明显差异，证明在胆脂瘤中OC的活化因素明显增强，OC被激活，骨破坏作用增强。OC参与的骨吸收过程表现为OC先附着于骨小梁边缘，将休止线及骨质溶解，形成陷窝，以后再在此处附加新生骨质，新、旧骨质间的粘合线变成弯曲波浪形。HE染色时，此波纹状粘合线为蓝色，提示OC参与了骨质破坏[8]。本研究通过光镜和电镜观察，在破坏听小骨骨小梁的表面发现活性OC的存在，并见大量波纹状蓝染的骨质黏合线。
　　
　　Chole 等通过研究发现，在临床胆脂瘤标本中有活性的OC罕见，而在实验性胆脂瘤中却可见大量活性OC和OC前体细胞的存在[9]。本研究中仅观察到少数活性OC存在，分析造成此种结果的原因是标本来源于需要手术的患者，这些患者多数已经用过药物的保守治疗，临床常用的皮质激素类药物的局部应用会抑制OC；另外，电镜和光镜标本的取材和观察范围有限，加上观察样本较少，因此本研究只观察到少数活性OC存在。但是，在胆脂瘤中调节OC分化成熟的关键因子RANKL和RANKL/OPG的表达明显增高，OC的活化因素明显增强，而且在光镜及电镜中观察到活性OC，证实OC参与胆脂瘤的骨质破坏。

参考文献

　　[1] Jung J Y，Chole A R. Bone resorption in chronic otitis media: The role of the osteoclast[J]. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec， 2002，64(1):95107.

　　[2] Lacey D L，Tan H L，Lu T，et al. Osteoprotegerin ligand modulates murine osteoclast survival in vitro and in vivo[J]. Am J Pathol， 2000，157(2):435448.

　　[3] Asagiri M，Takayanagi H. The molecular understanding of osteoclast differentiation[J]. Bone， 2007，40(2):251264.

　　[4] Boyle W J，Simonet W S，Lacey D L. Osteoclast differentiation and activation[J]. Nature， 2003，423(6937):337342.

　　[5] Wong B R，Josien R，Choi Y. TRANCE is a TNF family member that regulates dendritic cell and osteoclast function[J]. Leukoc Biol， 1999，65(6):71524.

　　[6] Lagasse E，Weissman I L. Enforced expression of Bcl2 in monocytes rescues macrophages and partially reverses osteopetrosis in op/op mice[J]. Cell， 1997，89(7):10211031.

　　[7] Blair J M，Zhou H，Seibel M J，et al. Mechanisms of Disease: roles of OPG， RANKL and RANK in the pathophysiology of skeletal metastasis[J]. Nat Clin Pract Oncol， 2006，3(1):4149.

　　[8] 同济医科大学病理学教研室，中山医科大学病理学教研室. 外科病理学下册[M]. 2版. 武汉：湖北科学技术出版社， 1999:892893.

　　[9] Chole R A. Cellular and subcellular events of bone resorption in human and experimental cholesteatoma: the role of osteoclasts[J]. Laryngoscope， 1984，94(1):7695.