金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶基因的序列特性分析

【摘要】 　　目的 获得酸性海藻糖酶基因(ATM1)并对其序列进行分析。 方法 根据已知序列设计引物，PCR扩增出金龟子绿僵菌ATM1的cDNA和DNA序列，对其推导的氨基酸序列基于多序列局部比对和结构的序列比对进行分析。 结果 ATM1 cDNA序列包含开放阅读框(ORF)3 219 bp，3’端非翻译区(3’UTR)175 bp和5’端非翻译区(5’UTR)498 bp。 结论 成功获得ATM1基因，通过序列分析确定出4组保守性功能序列。ATM1基因在CQMal02基因组中为单拷贝。

【关键词】 真菌； 海藻糖酶； 序列比对

　　海藻糖是一种非还原性二糖，占昆虫血淋巴中糖类80%～90%，在昆虫血液生理中起着重要作用，其耗竭可能对昆虫产生致命性的作用[1]。金龟子绿僵菌（metarhizium anisopliae，M.a）是一类应用广泛的昆虫病原真菌，在昆虫防治中起着重要作用。M.a侵染进入昆虫血淋巴后，海藻糖成为其生长的主要营养物质，绿僵菌能分泌酸性海藻糖酶，有效降解昆虫血淋巴中的海藻糖。因此酸性海藻糖酶在真菌对昆虫的致病过程中起着重要作用[2]。目前对真菌酸性海藻糖酶的研究只有少数几个物种的酸性海藻糖酶基因被克隆并测定序列[35]。本试验分离克隆M.a CQMal02的酸性海藻糖酶ATM1基因，并进行全序列分析，为构建M.a CQMal02 ATM1基因高效表达载体和干扰载体、对酸性海藻糖酶功能的进一步研究和采用基因工程手段改造绿僵菌菌株、提高其杀虫毒力提供理论基础和技术储备。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 菌株和质粒 M.a菌株CQMa102由重庆大学基因工程中心自罹病竹蝗僵虫体内分离培养纯化获得，中国微生物所菌种保存中心保存（保存编号0877）；质粒pMD18T（日本Takara公司）。

　　1.1.2 主要试剂 PrimeSTARTM DNA Polymerase、3’Full RACE Core Set，SmartTM PCR cDNA Synthesis Kit（日本Takara公司）；限制性内切酶、牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)、T4多核苷酸激酶(T4 PNK) 、mRNA提取试剂盒和PrimeaGene Labeling System标记试剂盒（美国Promega公司）；Hybond N尼龙膜（瑞典Phamarcia公司）；同位素aP32 dCTP（北京福瑞生物工程公司）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物设计 为获得ATM1基因cDNA的3’端和5’端序列，采用了3'RACE和SMART 5'RACE法(rapid amplification of cDNA ends)法，根据本实验室已获得的M.a酸性海藻糖酶部分肽段测序结果，设计引物如下：

　　AT631F
　　
　　上游：5’AATGTGGACAGCATCTCGGTTTGGAV3’

　　AT948F
　　
　　上游：5’TATCGTTTGTCAACCAACTCGTCGCG3’
　　
　　反转录引物
　　
　　S3：5’CAGTTCTGGTGATCC3’
　　
　　S4（下游）：5’TGGCGCTGCAAAGACCGAGAG3’
　　
　　S5（下游）：5’TTGATGGGCTCGCGAGTT3’

　　为获得ATM1基因DNA序列，根据ATM1基因全长cDNA序列设计一对特异引物E1、E2，PCR扩增出ATM1 DNA序列。
　　
　　E1(上游)：5’GTTGTCCCGGTGGCATTTGCTT3’
　　
　　E2(下游)：5’CATGTGATGGCCACTCCT3’

　　1.2.2 总DNA和mRNA的提取 将M.a孢子106接种于20 mL 1／4 SDA(1／4Strength Sabourauds Dextrose Agar)培养液，180 r／min离心，26～28 ℃培养60 h，10 000 r／min离心5 min，沉淀菌丝，无菌水冲洗2次，提取M.a CQMal02总DNA。
　　
　　将M.a CQMa102孢子106接种于酸性海藻糖酶产酶诱导培养液中[可溶性淀粉 10 g/L，海藻糖10 g/L，硫酸铵2 g/L，氯化钾 1 g/L，五水硫酸镁0.5 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，2（N吗啉）乙基磺酸10 g/L，微量元素（0.1% 七水硫酸亚铁，0.3%五水硫酸锌）10 mL/L，pH调至6.0～6.1]培养60 h后，收集M.a CQMa102新鲜菌丝，无菌水冲洗2次，加入液氮研磨成粉末，称取约50 mg菌丝粉末，用试剂盒提取mRNA。提取过程参照试剂盒说明书进行。

　　1.2.3 克隆ATM1基因5’端和3’端cDNA序列 根据M.a CQMal02酸性海藻糖酶已知的肽段测序结果，设计一条反转录引物S3和2条嵌套式PCR引物S4及S5，以M.a CQMal02 mRNA 500 ng为模板，按照5’Full RACE Core Set描述的操作程序进行，首先以S3为反转录引物合成第一链cDNA，然后以其为模板，利用该试剂盒提供的5’PCR Primer II A 和下游特异引物S4、S5，PCR扩增出ATM1基因5’端cDNA序列，然后将回收纯化后的PCR产物经PCR在3’端加A，并将产物连接到pMD18T Vector上。进行转化、阳性克隆菌株的筛选及电泳鉴定。克隆菌株由上海Sangon公司进行DNA序列测定，并对测序结果进行分析。
　　
　　同样，以M.a CQMal02 mRNA 500 ng为模板，首先利用3’Full RACE Core Set提供的Oligo dT3 sites Adapter primer为反转录引物合成第一链cDNA，然后以其为模板，利用该试剂盒提供的3 sites Adapter primer和上游特异引物AT631F、AT948F，PCR扩增出ATM1基因3’端cDNA序列，操作同上。
　　
　　将以上获得的ATM1基因的5’、3’端cDNA序列拼接，得到M.a CQMal02 ATM1全长cDNA。根据该全长cDNA序列设计一对引物E1、E2，以M.a CQMal02基因组DNA为模板，PCR扩增出ATM1完整基因片段，并经克隆、测序获得ATM1基因全长DNA序列。

　　1.2.4 Southern杂交 根据ATM1基因的测序结果，设计一对引物L1、L2：
　　
　　L1（上游）：5’TCCTTGATGGCTATTCCGC3’
　　
　　L2（下游）：5’GCATTCGCTTTGGCTTGG3’

　　以M.a CQMal02基因组DNA为模板PCR扩增DNA片段P(730 bp)，克隆并测序该片段。以该片段P为模板，利用同位素aP32 dCTP制备探针，以此探针与经限制性内切酶EcoR I、HindⅢ、AatⅡ完全酶切、电泳、转膜后的M.a CQMa102 总DNA做Southern杂交。其操作过程参照文献[6]。

　　1.2.5 ATM1氨基酸序列分析 采用BLAST软件从NCBI的蛋白质数据库中找到相应的海藻糖酶的氨基酸序列[7]。再利用BLOCK软件对所得序列进行局部比对，将序列分成若干个保守性功能区域[8]。利用FUGUE在蛋白质数据库中搜索与ATM1结构相似的序列，并将这些蛋白的结构信息与ATM1的序列进行比对[9]。

　　2 结果

　　2.1 M.a CQMal02 ATM1基因的克隆和分析 根据M.a酸性海藻糖酶部分肽段测序结果，采用5’RACE和3’RACE扩增出ATM1 cDNA的5’和3’端序列，经拼接得到M.a酸性海藻糖酶ATM1 cDNA全长。根据其全长cDNA序列，设计引物E1、E2，PCR扩增、克隆M.a CQMal02 ATM1完整基因。比较M.a酸性海藻糖酶ATM1基因组序列（NCBI，登录号DQ237957）和cDNA序列(NCBI，登录号EF190950）发现，ATM1基因含有3个内含子，有典型的GT…AG边界，该cDNA序列包含开放阅读框3 219 bp， 3’端非翻译区(3’UTR)175 bp和5’端非翻译区(5’UTR)498 bp。开放阅读框编码一个含1 073个氨基酸的蛋白质，其推导的相对分子质量为1 163 kDa。

　　2.2 Southern杂交结果 以此L1和L2为引物对，PCR扩增出DNA片段P(730 bp)，并克隆、测序。其测序结果表明，该DNA片段不含EcoR I、HindⅢ、AatⅡ等限制性内切酶位点。再用该片段P制备探针，与经限制性内切酶EcoR I、HindⅢ、AatⅡ完全酶切、电泳、转膜后的M.a CQMal02总DNA做Southern 杂交，3个酶切DNA均显示一条特异杂交带(图1)。

　　1：AatⅡ酶切；2：EcoRⅠ酶切；3：HindⅢ酶切.

　　图1 金龟子绿僵菌ATM1基因Southern杂交分析（略）

　　Fig 1 Southern blot analysis of the acid trehalase gene of M.anisopliae CQMa102

　　2.3 氨基酸序列分析 从NCBI的蛋白质数据库中搜索到的已发表的并确认是酸性海藻糖酶的相关序列共有8条（表1）。
　　
　　将9条酸性海藻糖酶采用BLOCK程序进行比对，共得到3个保守序列段，如图2所示，它们的长度分别是50，49，50个氨基酸。在图2可发现一些进化中相对保守的氨基酸，并得到4个较保守的序列为AXYPWTSGRFGNCTXTGPCXDYXYH、NGWPL、PYXRXPFXQFSEQ、NGGTHPAXPFLT(X表示该位氨基酸相对不保守)。
　　
　　利用FUGUE程序检索到与ATM1具有相似结构的已知结构的蛋白，一共搜索到2个ZSCORE>6.0，其中h54(NCBI登录号为gi:15988492)的ZSCORE=16最高，将ATM1与h54和2eab进行了基于结构的序列比对，发现利用BLOCK生成的4个保守序列在这些序列中同样是保守的。

　　表1 目前已发表的酸性海藻糖酶（略）

　　Tab 1 Acid Trehalase having been published

　　将9条酸性海藻糖酶采用BLOCK程序进行比对，共得到3个保守序列段，如图2所示，它们的长度分别是50、49、50个氨基酸。在图2可发现一些进化中相对保守的氨基酸，并得到4个较保守的序列为AXYPWTSGRFGNCTXTGPCXDYXYH、NG进化中相对保守的氨基酸，并得到4个较保守的序列为AXYPWTSGRFGNCTXTGPCXDYXYH、NG
　　
　　利用FUGUE程序检索到与ATM1具有相似结构的已知结构的蛋白，一共搜索到2个ZSCORE>6.0，其中h54(NCBI登录号为gi:15988492)的ZSCORE=16最高，将ATM1与h54和2eab进行了基于结构的序列比对，发现利用BLOCK生成的4个保守序列在这些序列中同样是保守的。

　　图2 BLOCK生成的保守序列(Logos )（略）

　　Fig 2 Conservative sequences produced by Block

　　3 讨论
　　
　　本实验室赵华等已纯化出M.a酸性海藻糖酶[2]。在这基础上结合RACE等手段，分离出绿僵菌酸性海藻糖酶基因cDNA全序列，NCBI的GenBank登录号为：EF190950（cDNA序列）。笔者克隆的基因在其推导的氨基酸序列中可以找到纯化蛋白氨基酸分析得到的几段多肽氨基酸序列片段[2]，进一步验证了笔者分离出的基因是编码纯化的酸性海藻糖酶的基因。
　　
　　将绿僵菌酸性海藻糖酶cDNA序列用NCBI Blastn工具与数据库进行比对，在多序列比对中，很明显某些位置的氨基酸残基相对于其它位置的残基具有较高的保守性，这个信息一般会揭示某些残基对于一个蛋白质的结构和功能是极为重要的。由于历史原因，某些保守位置对蛋白功能并无太大的重要性，相似性在某些情况下更多是历史的反映，而非功能的反映，这种现象尤其是在物种亲缘关系比较近时会经常发生。因此不可能仅从序列比对的结果来确定功能序列，必须引入结构信息才能准确地确定保守的功能序列。序列比对可分成2种，即全局比对和局部比对。由于蛋白质具有模块性质，局部比对的结果将比全局比对的结果更具有生物学意义。因此笔者引入了基于结构的序列比对并结合序列的局部比对，使确定的保守性功能序列更有生物学意义。

参考文献

　　[1] Xia Y，Clarkson J M，Charnley A K. Trehalosehydrolysing enzymes of Metarhizium anisopliae and their role in pathogenesis of the tobacco hornworm[J]. Manduca Sexta Journal of invertebrate pathology， 2002，80(3):139147.

　　[2] Zhao H，Charnley A K，Wang Z，et al. Identification of an extracellular acid trehalase and its gene involved in fungal pathogenesis of Metarizium anisopliae[J]. Biochem(Tokyo)， 2006，(140):319327.

　　[3] Destrulle M， Holzer H，Klionsky D J. Isolation and characterization of a novel yeast gene， ATH1， that is required for vacuolar acid trehalase activity[J]. Yeast， 1995，11(11):10151025.

　　[4] Pedreno Y， Maicas S， Arguelles C， et al. The ATC1 gene encodes a cell walllinked acid trehalase required for growth on trehalose in Candida albicans[J]. The Journal of Biological Chemistry， 2004，279:4085240860.

　　[5] d'Enfert C， Fontaine T. Molecular characterization of the Aspergillus nidulans treA gene encoding an acid trehalase required for growth on trehalose[J]. Molecular microbiology， 1997，24:203216.

　　[6] Sambrook J， Fritsch E F， Maniatis T．分子克隆实验指南[M].金冬雁，黎孟枫，译． 2版．北京:科学出版社，1992：155159.

　　[7] A1tschul S F，Gish W，Miller W，et al．Basic local alignment search tool[J]. J Mol Biol，1990，215(3):403410．

　　[8] Henikoff S，Henikoff J G，Afford W J，et al．Automated construction and graphical presentation of protein blocks from unaligned sequences [J]．Gene，1995，163(2)：1726．

　　[9] Shi J， Bltmdell T L， Mizuguchi K．FUGUE：sequencestructure homology recognition using environmentspecific substitution table and structuredependent gap penalties[J]．J Mol Biol，2001，310(1)：243257．